抗體C端K缺失比例分析

——即抗體C端K缺失比例分析技術(shù)服務(wù)

抗體類蛋白質(zhì)藥物分子重鏈C末端賴氨酸會(huì)有不同程度的缺失現(xiàn)象發(fā)生，質(zhì)量控制中需要建立對(duì)這類現(xiàn)象的定性和定量分析的方法。C端賴氨酸 (K) 缺失后，會(huì)造成供試品酶解后C末端多肽分子的序列發(fā)生變化，并且這兩種C末端多肽分子（缺失或者不缺失K）的定量結(jié)果可以反映蛋白質(zhì)分子C端賴氨酸的缺失程度。

現(xiàn)代分析技術(shù)的發(fā)展，使得LC-MS技術(shù)可以運(yùn)用到對(duì)多肽分子的定性和定量實(shí)驗(yàn)中。因此，本實(shí)驗(yàn)需要在合成供試品的理論C端多肽分子和缺失賴氨酸C端多肽分子的基礎(chǔ)上，使用外標(biāo)法建立起對(duì)供試品的C端賴氨酸缺失程度的定性定量方法。

圖為Orbitrap示意圖

“生物質(zhì)譜技術(shù)可以在蛋白質(zhì)樣品的翻譯后修飾定性定量分析中得到廣泛應(yīng)用”

生物質(zhì)譜技術(shù)在定量分析中的應(yīng)用

對(duì)C末端K缺失進(jìn)行測(cè)定主要方法是基于質(zhì)譜鑒定中的SIM掃描。SIM全稱是單離子檢測(cè)掃描（single ion monitoring，單離子監(jiān)測(cè)），只針對(duì)一級(jí)質(zhì)譜而言，即只掃一個(gè)離子，對(duì)于已知的化合物，提高某個(gè)離子的靈敏度，并排除其它離子的干擾。另外，LC-MS技術(shù)在進(jìn)行定量實(shí)驗(yàn)時(shí)，常用三重四級(jí)桿進(jìn)行MRM，但隨著技術(shù)發(fā)展，質(zhì)譜的分辨率和動(dòng)態(tài)范圍都有很大的提高。

技術(shù)指標(biāo)

本方法所檢測(cè)的樣品是蛋白質(zhì)或多肽類供試品，測(cè)量的是蛋白質(zhì)C末端多肽分子賴氨酸缺失比例，測(cè)定的是多肽分子的氨基酸序列和其相對(duì)強(qiáng)度。

蛋白質(zhì)或者多肽供試品既可以是固體樣品，也可以說(shuō)溶液樣品。供試品的量應(yīng)該不少于200μg，供試品如果為固體，應(yīng)為蛋白質(zhì)多肽凍干制品；如果供試品為液體，樣品中蛋白質(zhì)多肽濃度應(yīng)盡可能在2mg/ml以上。

本方法采用外標(biāo)法。標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)度應(yīng)大于0.9。質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)軟件MASCOT分析，鑒定肽段的significant P需小于0.05，且Mascot Score值需大于20。

蛋白質(zhì)C末端測(cè)定方法所使用的儀器是，Thermo公司生產(chǎn)的高校液相串聯(lián)質(zhì)譜儀Q Exactive和Easy Nlc1000。

案例分析

下圖顯示一個(gè)K缺失實(shí)驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)肽段的標(biāo)準(zhǔn)曲線（XIC積分值）。

下圖為抗體蛋白質(zhì)供試品的C末端K缺失比例的XIC圖譜。

Q&A

1)抗體C端K缺失比例分析實(shí)驗(yàn)參數(shù)的簡(jiǎn)介。

2)質(zhì)譜定量實(shí)驗(yàn)中的內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法選擇。

內(nèi)標(biāo)法是在分析測(cè)定樣品中某組分含量時(shí)，加入一種內(nèi)標(biāo)物質(zhì)以校準(zhǔn)和消除出于操作條件的波動(dòng)而對(duì)結(jié)果產(chǎn)生的影響。采用內(nèi)標(biāo)法定量時(shí)，內(nèi)標(biāo)物的選擇是一項(xiàng)十分重要的工作。理想地說(shuō)，內(nèi)標(biāo)物應(yīng)當(dāng)是一種能得到純樣的已知化合物，這樣它能以準(zhǔn)確、已知的量加到樣品中去，它應(yīng)當(dāng)和被分析的樣品組分有基本相同或盡可能一致的物理化學(xué)性質(zhì)、色譜行為和響應(yīng)特征，最好是被分析物質(zhì)的一個(gè) 同系物。當(dāng)然， 在色譜分析條件下，內(nèi)標(biāo)物必須能與樣品中各組分充分分離。

外標(biāo)法不是把標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)加入到被測(cè)樣品中，而是在與被測(cè)樣品相同的色譜條件下單獨(dú)測(cè)定，把得到的色譜峰面積與被測(cè)組分的色譜峰面積進(jìn)行比較求得被測(cè)組分的含量。外標(biāo)物與被測(cè)組分同為一種物質(zhì)但要求有一定的純度，分析時(shí)外標(biāo)物的濃度應(yīng)與被測(cè)物濃度相接近，以利于定量分析的準(zhǔn)確性。