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DNA 測(cè)序服務(wù)
DNA測(cè)序技術(shù)主要依據(jù) Sanger 的雙脫氧鏈終止法。
服務(wù)類別:測(cè)序/合成總訪問(wèn):475
最后更新:2017-8-14半年訪問(wèn):21
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DNA 測(cè)序服務(wù)
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DNA測(cè)序原理

DNA測(cè)序技術(shù)主要依據(jù) Sanger 的雙脫氧鏈終止法。以DNA單鏈為模板,在特定條件下,用特異的引物在測(cè)序級(jí)DNA聚合酶的作用下,根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則,不斷將 4 種脫氧核糖核苷酸 (dNTP) 加到引物的 3'- 羥基末端并使引物鏈得到延伸。這種鏈的延伸是通過(guò)引物的 3'- 羥基和脫氧核糖核苷酸底物的 5'- 磷酸基團(tuán)形成磷酸二酯鍵來(lái)完成的。如果這種反應(yīng)體系中加入雙脫氧核糖核苷酸 (ddNTP) ,這種 2'3'ddNTP 的 5'- 磷酸基團(tuán)是正常的 (4 種不同的熒光標(biāo)記 ) ,而 3' 位置缺少羥基,因此在 DNA 聚合酶作用下,仍然可以通過(guò) 5'- 磷酸基團(tuán)與引物鏈的 3'- 羥基反應(yīng)摻入到引物鏈中,但是由于 ddNTP 沒(méi)有 3'- 羥基,不能繼續(xù)與下一個(gè) 5'- 磷酸基團(tuán)形成磷酸二酯鍵而導(dǎo)致引物鏈延伸的終止。這樣,在測(cè)序反應(yīng)體系中, DNA 引物鏈不斷合成與偶然終止,產(chǎn)生一系列的長(zhǎng)短不等的核苷酸鏈,然后將這些反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳,即可得測(cè)序圖譜。

樣品要求

樣品類型

相應(yīng)要求

 

 

菌體

1. 說(shuō)明載體抗性類型,我們提供 Amp, Kan, Tet 及 Chl 四種抗生素。 
2.   提供 1ml 左右過(guò)夜培養(yǎng)的菌液,加 15% 滅菌甘油,于 Eppendorf 管中封口保存,防止交叉污染或滲漏。 
3.   大量樣品測(cè)序,建議在一次性塑料培養(yǎng)皿固體培養(yǎng)基上穿刺培養(yǎng)。 
4.   建議盡量提供穿刺培養(yǎng)的菌種。

 

質(zhì)粒

1. 質(zhì)粒溶于適量體積雙蒸水中(不含 TE ),電泳檢測(cè)總量大于 2mg 。

2. 建議用相關(guān)試劑盒純化。 
3. 如有可能,同時(shí)提供 1ml 含有相應(yīng)質(zhì)粒的菌液備用。 
4. 大質(zhì)粒必需注明載體長(zhǎng)度。

 

未純化 PCR 產(chǎn)物

1. 片段大于 150bp 。 
2. 提供 50ul ~ 100ul PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物 ( 總量 500ng-1ug) 。 
3. 取 3ul 樣品,電泳檢測(cè)應(yīng)為明亮的一條帶,無(wú)雜帶。

 

純化 PCR 產(chǎn)物

1.PCR 產(chǎn)物溶于雙蒸水中(不含 TE )。

2. 濃度大于 20ng/ul ,體積大于 20ul ,長(zhǎng)片段需適當(dāng)增加量。 
3. 電泳檢測(cè)條帶專一。

自備的引物

1. 濃度不低于 5pmole/ul( 或 5umol/L) ,體積大于 20ul 。 
2. 隨機(jī)引物和簡(jiǎn)并引物不能用于測(cè)序。 
3. 盡可能提供引物全序列、 PCR 退火溫度,以供參考。

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