m6A RNA甲基化測序

技術簡介

近年來，科學家們首次發(fā)現(xiàn)了一種可逆的RNA甲基化—m6A，即RNA分子腺嘌呤第6位氮原子上發(fā)生甲基化修飾(N6-methyladenosine，m6A)。研究發(fā)現(xiàn)，m6A是真核生物mRNA上最常見的一種轉錄后修飾，m6A在細胞加速mRNA代謝和翻譯，以及在細胞分化、胚胎發(fā)育和壓力應答等過程中起重要作用。種種研究跡象表明m6A 存在于很多物種中，占到了 RNA甲基化修飾的80%。m6A除了分布在 mRNA 中，也出現(xiàn)在很多非編碼 RNA中 ，如：環(huán)狀RNA 、LncRNA等。Nature正刊發(fā)表文章，證實發(fā)生m6A RNA甲基化修飾可以調(diào)控mRNA穩(wěn)定性。而隨后Cell Research也發(fā)表文章，證實環(huán)狀RNA也會被m6A甲基化修飾，并會促進環(huán)狀RNA編碼蛋白這一有趣的結論。

　　 云序生物(m6A)RNA甲基化測序流程

云序生物RNA甲基化測序產(chǎn)品

云序優(yōu)勢

一站式服務：

客戶只需提供細胞、組織或RNA，云序生物為您完成從MeRIP富集，文庫制備，上機測序到數(shù)據(jù)分析整套服務流程。

優(yōu)化的實驗流程：

MeRIP的富集效率是決定數(shù)據(jù)質量的關鍵，云序生物MeRIP實驗采用預驗證的商業(yè)化抗體和精心優(yōu)化的實驗流程，具有極高的效率和特異性。

嚴格的質控：

云序生物對MeRIP實驗的各個關鍵步驟進行嚴格的質控，全程監(jiān)控實驗質量，確�？蛻舻玫絻�(yōu)質的數(shù)據(jù)。

專業(yè)的生物信息學分析：

云序生物具有強大的生物信息學團隊，能夠滿足客戶的各類深入數(shù)據(jù)分析需求。

特異性高：

通過抗體特異性富集發(fā)生甲基化修飾的RNA片段，以較低的成本實現(xiàn)轉錄組范圍的RNA甲基化研究。

樣本要求：

樣品類型：

細胞、組織或基因組RNA，其他樣本類型請電詢。

樣品量：

a) 細胞：1×10⁸

b) 組織：5 g

c) RNA：300 μg (OD260/280：1.6-2.3; RNA無明顯降解; 28S:18S>1.5或RIN>7)

樣品運輸及保存：

樣品運輸：樣品置于1.5mL離心管中，封口膜封好，干冰運輸。

樣品保存：細胞樣品或新鮮組織塊可用TRIZOL或RNA保護劑處理，液氮凍存后-80℃保存;RNA樣品可溶于乙醇或RNA-free的超純水中，-80℃保存，避免反復凍融。

數(shù)據(jù)分析

1. 識別甲基化富集峰

通過高通量測序和生物信息分析，識別(p <10^-5)甲基化富集的基因組區(qū)域。

注：每個樣品組做一個Input，以去除基因組背景，降低假陽性率

 

2. RNA甲基富集峰注釋

通過生物信息分析利用最鄰近基因對富集峰進行注釋，并根據(jù)峰中點相對于已知基因的位置，將富集峰為啟動子峰、上游峰、內(nèi)含子峰、外顯子峰、基因間峰。

             

 

3. RNA甲基化富集峰區(qū)域的在基因組中的分布

根據(jù)注釋信息，繪制富集峰在不同基因組特征上的比例圖。

                    

 

4. RNA甲基化位點Motif分析

RNA上甲基化的位點，可能包含某種序列motif。RNA甲基化酶可能正是通過識別這些motif特異性進行甲基化修飾，從而完成轉錄后調(diào)控功能。我們成功識別了全基因組的RNA上的甲基化位點后，獲取序列就能使用生物信息學的手段來搜索這些motif，從而揭示RNA甲基化修飾的機制。

5. 差異RNA甲基化區(qū)域的識別與聚類

云序生物使用 diffReps 軟件進行差異甲基化位點的識別。默認篩選標準為 FDR<=0.05，具體以報告為準。 識別樣本間的差異甲基化區(qū)，發(fā)現(xiàn)與特定表型或疾病相關的甲基化區(qū)域。

6. 差異甲基化區(qū)的GO與信號通路分析

對差異甲基化基因進行功能分類，并發(fā)現(xiàn)顯著性富集的功能條目。

 

7. Reads 的分布

使用 ngs.plot 工具可以展示匹配 reads 在 TSS， genebody， TES 等位點的分布情況，可以用來觀察 RNA 甲基化對TSS 等位點是否有偏好。

 

 

案例分析

案例1：擬南芥花葉根組織m6A RNA甲基化譜

原文：Transcriptome-wide high-throughput deep m6 A-seq reveals unique differential m6 A methylation patterns between three organs in Arabidopsis thaliana

期刊：Genome Biology 影響因子：13.21

西北農(nóng)林科技大學聯(lián)合中科院和普渡大學，借助m6A RNA甲基化測序技術，對比擬南芥花，葉，根組織中（每種組織有兩個生物學重復）m6A RNA甲基化情況。結果發(fā)現(xiàn)檢測組織中m6A RNA甲基化修飾程度比人類高10%左右，占轉錄組的83%。

 

圖1. 比較擬南芥花，葉，根組織中m6A RNA甲基化情況

 

案例2：不同品系擬南芥m6A RNA甲基化譜 

原文：Unique features of the m6A methylome in Arabidopsis thaliana

期刊：Nature communications 影響因子：12.12

芝加哥大學聯(lián)合北大，利用m6A RNA甲基化測序對比和品系擬南芥根組織中m6A RNA甲基化譜，發(fā)現(xiàn)的分布在兩個品種間高度保守。與人類m6A RNA甲基化位點分布情況相比，擬南芥甲基化位點在起始翻譯區(qū)特異性高表達。

 

 

圖2. 不同品系，同一基因上甲基化 

 

案例3：m6A RNA去甲基化酶ALKBH5通過結合lncRNA促進膠質瘤細胞

原文：m6A Demethylase ALKBH5 Maintains Tumorigenicity of Glioblastoma Stem-like Cells by Sustaining FOXM1 Expression and Cell Proliferation Program 

期刊：Cancer Cell 影響因子：27.43 

世界衛(wèi)生組織將膠質瘤分為四級，其中惡性膠質瘤(GBM)屬于最危險的第四級，手術治療和化療都難以避免其高復發(fā)率。近年來，m6A RNA修飾的研究已成為當今生命科學領域最前沿研究之一，不斷有高分文章問世。m6A RNA修飾的催化、去除以及識別的分子機理研究越來越清晰，此時人們更關心m6A RNA修飾與重大疾病之間的相關性。近期Cancer Cell報道了m6A RNA去甲基化酶ALKBH5在神經(jīng)膠質瘤中具有生理作用。在本研究中，去甲基化酶ALKBH5在惡性膠質瘤干性樣細胞表達上調(diào)，而ALKBH5高表達的膠質細胞瘤患者預后生存率更差。通過敲低ALKBH5，meRIP鑒定m6A RNA甲基化修飾模式，基因芯片檢測差異表達>2倍的基因，最終篩選到與細胞周期調(diào)控相關的FOXM1基因，其在GSCs的自我修復和腫瘤形成中起到關鍵作用。ALKBH5促使癌基因FOXM1轉錄本去甲基化，增加FOXM1表達。隨后作者發(fā)現(xiàn)FOXM1反義長鏈非編碼RNA——FOXM1-AS(LOC100507424)，與FOXM1 mRNA最后一個外顯子有457個核苷酸互補。結果證實ALKBH5和FOXM1-AS可與FOXM1協(xié)同作用，發(fā)揮促進惡性膠質瘤腫瘤形成作用。 

              

             圖3. ALKBH5和FOXM1-AS可與FOXM1協(xié)同作用，促進惡性膠質瘤腫瘤形成