10xGenomics單細胞測序

       單細胞測序技術(shù)在2013年被 Nature Methods 評為年度技術(shù)，被Science評為年度六大生物類科研熱點的首位，又在2015年登上Science轉(zhuǎn)化醫(yī)學封面。 Nature Methods 將2019年年度技術(shù)又給了單細胞多組學。2013年以來基于單細胞測序技術(shù)獲得了多方面的研究進展，文獻發(fā)表也呈現(xiàn)迅猛增長趨勢。即使來源相同的單個細胞，由于隨機生物過程和環(huán)境擾動的原因，彼此在許多方面也存在差異，即異質(zhì)性。尤其是腫瘤細胞、免疫細胞、胚胎發(fā)育期細胞、干細胞等最為突出。常規(guī)的組學技術(shù)發(fā)現(xiàn)不了這一現(xiàn)象帶來的影響，由此研究人員開啟了單細胞測序技術(shù)的探索之路。

Pubmed收錄“single-cell sequencing”文獻統(tǒng)計

技術(shù)原理：

       單細胞轉(zhuǎn)錄組測序利用GemCode™技術(shù)的微流控技術(shù)進行單個細胞分選，將帶有條形碼和引物的凝膠珠和單個細胞包裹在油滴中；在每個油滴內(nèi)，凝膠珠溶解，細胞裂解釋放mRNA，通過逆轉(zhuǎn)錄把凝膠珠的特異性barcode引入到cDNA并用于區(qū)分細胞；液體油層破壞后，cDNA后續(xù)進行文庫構(gòu)建，結(jié)合illumina測序平臺對文庫進行測序檢測，即可一次性獲得大量單細胞的基因表達數(shù)據(jù)，從而達到在單細胞水平進行表達測序的目的。10x GenomicsﾠChromium Single Cell單細胞測序技術(shù)的發(fā)展，極大地促進了單細胞組學研究。

實驗流程：

技術(shù)特點：
● 真正意義上的單細胞檢測（每一個細胞形成單獨的GEM，分別進行細胞標記）；
● 超低的單個細胞價格；
● 多細胞捕獲率低；
● 超高的捕獲效率（單個細胞捕獲效率高達65%）；
● 全自動真正單細胞分離、實驗周期短；
● 超高的細胞通量（每個樣本最多可測10000個細胞，HT每個樣本可檢測高達20000個細胞）；
● 細胞類型多樣化（適宜40μm直徑以內(nèi)，無下限）；
● 通量高（可同時進行8通道檢測，HT可同時進行16通道檢測）。

產(chǎn)品分類：

● 單細胞轉(zhuǎn)錄組
   單細胞轉(zhuǎn)錄組測序能夠?qū)Ξ愘|(zhì)群體中的細胞亞群進行全面的研究，追蹤單個細胞的表達譜，鑒定稀有細胞類型，有效地解決組織樣本無法破解的細胞異質(zhì)性難題。
● 單細胞基因表達Flex
   單細胞基因表達Flex以非常高的靈活性帶來了超高靈敏度的全轉(zhuǎn)錄組分析，樣本在固定的同時鎖定生物學狀態(tài)，這樣可以保存脆弱樣本，并且樣本可以大規(guī)模、長時間、穩(wěn)定的運輸。此產(chǎn)品有獨特的探針設計，探針雜交的同時可以進行樣本標記，實現(xiàn)多樣本的混樣，在一定程度上降低了成本。樣本在固定后可進行長期儲存。在樣本類型上，此產(chǎn)品可兼容FFPE樣本。
● 單細胞免疫組庫
   單細胞免疫組庫測序解決了TCR/BCR雙鏈匹配的問題，可以在單細胞水平完美匹配TCR/BCR雙鏈。
● 單細胞轉(zhuǎn)錄組、免疫組庫+表面蛋白
   單細胞轉(zhuǎn)錄組或免疫組庫能夠?qū)�細胞�?nèi)轉(zhuǎn)錄組及免疫組庫進行分析，巧妙利用 Feature Barcode技術(shù)及Biolegend配套抗體，同時檢測表面蛋白表達變化。
● 單細胞ATAC-seq
   在單細胞層面利用改造后活性極高的轉(zhuǎn)座酶切割開放染色質(zhì)區(qū)域，對此區(qū)域進行測序，是轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制研究領域的一種高效、簡便的方法。
● 單細胞ATAC+轉(zhuǎn)錄組測序
   整合單細胞ATAC測序和轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，可以同時在一個細胞內(nèi)研究基因表達和染色質(zhì)開放性。

樣品要求：
● 細胞總量：細胞總數(shù)大于5×105個
● 樣品濃度：7×105-1.2×106cells/mL
● 細胞活率：大于80%
● 細胞成團率：小于5%
● 細胞大�。盒∮�40μm
● 細胞培養(yǎng)基及緩沖液不能含有Ca2+和Mg2+等影響酶活性的物質(zhì)
● 組織需解離成單細胞懸液，植物細胞需制成原生質(zhì)體

應用領域：

數(shù)據(jù)結(jié)果展示：

應用案例（一）

CD36+癌相關(guān)成纖維細胞通過分泌巨噬細胞遷移抑制因子為肝細胞癌提供免疫抑制微環(huán)境
影響因子：38.079
發(fā)表時間：2023.03
發(fā)表期刊：Cell Discovery
原文：CD36+ cancer-associated fibroblasts provide immunosuppressive microenvironment for hepatocellularcarcinoma via secretion of macrophage migration inhibitory factor

       肝細胞癌(HCC)是一種具有高度細胞異質(zhì)性的免疫治療耐藥惡性腫瘤。細胞類型的多樣性以及腫瘤細胞與非腫瘤細胞之間的相互作用仍有待闡明。人類和小鼠HCC腫瘤的單細胞RNA測序顯示癌癥相關(guān)成纖維細胞(CAF)的異質(zhì)性�？缥锓N分析發(fā)現(xiàn)CD36+ﾠCAFs表現(xiàn)出高水平的脂質(zhì)代謝和巨噬細胞遷移抑制因子(MIF)表達。此外，CD36在CD36+ﾠCAFs中通過脂質(zhì)過氧化/p38/CEBPs軸介導氧化性LDL攝取依賴的MIF表達，CD36+ﾠCAFs以MIF和CD74依賴的方式招募CD33+ﾠ髓源性抑制細胞(MDSCs)。CD36+ﾠCAFs與HCC細胞共植入促進HCC在體內(nèi)的進展。最后，CD36抑制劑與抗PD-1免疫治療協(xié)同作用，通過恢復HCC中的抗腫瘤T細胞反應。研究者的工作強調(diào)了闡明特定CAF亞群功能在理解腫瘤微環(huán)境和免疫系統(tǒng)之間相互作用的重要性。
 

應用案例（二）
單細胞免疫組庫測序揭示新冠感染和接種疫苗后BCR的變化
影響因子：19.568
發(fā)表時間：2022.12
發(fā)表期刊：Emerging Microbes & Infections
原文：Comparative global B cell receptor repertoire difference induced by SARS-CoV-2 infection

       為了研究SARS-CoV-2感染和接種滅活疫苗的健康/感染康復者之間BCR的動態(tài)差異，研究者對接種過3針滅活疫苗的健康人、接種滅活疫苗的康復患者、未接種過疫苗的康復患者進行單細胞轉(zhuǎn)錄組+BCR測序，然后與4名感染患者的B細胞公開數(shù)據(jù)進行整合分析，發(fā)現(xiàn)BCR的V基因使用率在感染組（無論是否已康復）比疫苗接種組更顯著。感染后VH基因擴增最多的是IGHV3-33，而接種組中擴增最多的是IGHV3-23。感染組的BCR克隆性擴增和體細胞超突變均高于健康接種組，感染患者、接種疫苗的健康人和康復人群共享一小部分公共克隆型。此外，還鑒定了幾種針對SARS-CoV-2刺突蛋白的公共抗體。這些結(jié)果全面表征了從 SARS-CoV-2 感染到疫苗接種的BCR重鏈和輕鏈配對庫，為下一代精準疫苗的開發(fā)提供了進一步的指導。
研究背景：
       在SARS-CoV-2感染或疫苗接種后，B細胞會產(chǎn)生抗體，在獲得性免疫中起重要作用。在前人研究中，新冠感染或疫苗接種后V基因及免疫球蛋白特征已進行過很多研究，但輕重鏈的配對關(guān)系缺失。因此，本文利用單細胞免疫組庫測序方法對不同人群進行分析，從單細胞水平確認BCR的特征。
樣品分組：
       1.接種過3針滅活疫苗（BBIBP-CorV）的健康人6例（接種前后均進行檢測）；
       2.接種過1針BBIBP-CorV的康復患者5例；
       3.未接種過BBIBP-CorV的康復患者5例；
       4.SARS-CoV-2感染患者4例。