磁珠對PCR抑制原因與解決方案

隨著精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展以及二代測序成本的降低，分子診斷的市場需求逐年上升。磁珠作為分子診斷中核酸提取、探針捕獲等實(shí)驗(yàn)的重要原材料，為其實(shí)現(xiàn)高回收率、自動化發(fā)揮了重要的作用。

然而不同實(shí)驗(yàn)的洗脫效率對最終核酸分子的回收率有很大的影響（Tips:尤其在探針捕獲領(lǐng)域）。因此，為降低洗脫不完全以及洗脫試劑造成的污染，將捕獲了核酸的磁珠直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增，成為越來越多分子診斷與測序中常用的實(shí)驗(yàn)手段。也行有不少研究者發(fā)現(xiàn)，帶磁珠進(jìn)行PCR擴(kuò)增，會對PCR產(chǎn)生抑制作用，Dr. BEAVER這次為大家驗(yàn)證了磁珠抑制PCR的原因，以及解決方案。

那磁珠抑制PCR的可能性因素有哪些呢？

1.磁珠品牌；
2.磁珠使用量；
3.磁珠Fe離子泄露；
4.磁珠表面材質(zhì)及電荷的影響；
此研究還有很多需要改進(jìn)的地方，大家可在下方留言，共同探討。

不同品牌的SA磁珠對PCR的影響
我們選用了進(jìn)口磁珠以及兩種品牌的國產(chǎn)鏈霉親和素磁珠（SA磁珠）驗(yàn)證其對PCR的影響。結(jié)果出乎意料，進(jìn)口T1磁珠對PCR的抑制效果最為明顯。SA-1磁珠對PCR的影響強(qiáng)于SA-2磁珠。

圖1.不同品牌的磁珠（1 mg beads/50μL PCR）均對PCR具有不同程度的抑制。

不同濃度的SA磁珠對PCR抑制效果
為了驗(yàn)證不同磁珠使用量對PCR的抑制情況，我們選用了兩種SA磁珠，控制PCR體系中SA磁珠的濃度。結(jié)果顯示，低濃度磁珠對PCR的抑制很少，甚至可略微增強(qiáng)PCR反應(yīng)效率，但隨著磁珠濃度增加，對PCR抑制作用顯著上升。當(dāng)磁珠濃度達(dá)到0.5mg/50μL PCR時(shí)，抑制作用開始明顯，SA-1磁珠對PCR的影響強(qiáng)于SA-2磁珠（與上述結(jié)論相同）。

圖2：兩種不同濃度的SA磁珠投入PCR體系中，PCR產(chǎn)物的電泳圖。

Fe離子泄露對PCR的抑制作用
資料報(bào)道10μM 以上濃度的Fe離子會強(qiáng)烈抑制PCR。若磁珠在PCR過程中有鐵離子的滲出，則會導(dǎo)致對PCR的抑制。上述實(shí)驗(yàn)表明1mg/50μL PCR的磁珠均會對PCR產(chǎn)生抑制。但Fe離子泄露實(shí)驗(yàn)證明SA-2磁珠無Fe離子泄露，但仍然會抑制PCR反應(yīng)。

圖3：采用鄰菲啰啉法檢測檢測2種SA磁珠在PCR產(chǎn)物中Fe離子的濃度。

不同表面材質(zhì)及電荷的磁珠對PCR的抑制效果
本次實(shí)驗(yàn)我們選用2種不同表面的磁珠，其中一款為二氧化硅羥基表面。另外一款為聚合物羧基表面。兩種磁珠在PCR體系中均無Fe離子泄露，但都對PCR產(chǎn)生抑制，其中二氧化硅羥基磁珠更為明顯。

圖4：相同濃度二氧化硅羥基磁珠以及聚合物羧基磁珠（1mg beads/50μL PCR）PCR之后的產(chǎn)物電泳圖。

圖5：兩種磁珠在PCR體系中均無Fe離子泄露。磁珠抑制作用與漏鐵無明顯相關(guān)性。磁珠對PCR的抑制原因，更有可能是其表面材質(zhì)（或電荷）對PCR有抑制作用。

磁珠對PCR抑制解決方案：
總而言之，對PCR體系抑制是絕大部分的磁珠都存在的現(xiàn)象。海貍研發(fā)團(tuán)隊(duì)為了解決以上問題，配合磁珠試劑，開發(fā)了一款能夠消除磁珠對PCR影響的PCR增強(qiáng)試劑，能夠明顯降低磁珠對PCR的影響。

圖6.control為正常PCR產(chǎn)物，1、2、3、4為PCR體系中添加4種不同磁珠的PCR產(chǎn)物。1、2、3、4-Enhancer是在PCR體系中加入以上4中磁珠及4μL的增強(qiáng)試劑后PCR產(chǎn)物。