單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序/單細(xì)胞測序/BD單細(xì)胞測序分析

BD Rhapsody

BD Rhapsody 技術(shù)利用卡式芯片在磁性的寡核苷酸條形碼標(biāo)記微球上實現(xiàn)單細(xì)胞捕獲和 mRNA 轉(zhuǎn)錄本的分子標(biāo)簽，然后將這些微球合并到單個管中用于 cDNA 擴(kuò)增和文庫構(gòu)建�？蓾M足 100~10000 個細(xì)胞的自動分選、擴(kuò)增及建庫。

圖 BD Rhapsody 技術(shù)原理

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此外，該技術(shù)使用帶有寡核苷酸的高質(zhì)量抗體（Ab-oligos），這條寡核苷酸帶有抗體特異的條形碼，細(xì)胞在經(jīng)過 Ab-oligos 標(biāo)記后，可在單細(xì)胞水平同時獲得轉(zhuǎn)錄組和蛋白表達(dá)。

圖 單細(xì)胞 mRNA 與蛋白同時測序

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高 效	每個樣本可測  100~10000  個細(xì)胞；
	2 天內(nèi)完成細(xì)胞懸液制備、單細(xì)胞捕獲、擴(kuò)增以及建庫。
靈 活	抗體標(biāo)簽技術(shù)可實現(xiàn)多樣本混合捕獲；
	可選擇全轉(zhuǎn)錄組測序或目標(biāo)基因測序。
可靠	利用成像系統(tǒng)對單細(xì)胞捕獲過程進(jìn)行質(zhì)控；
	單細(xì)胞捕獲效率高達(dá) 80%，多細(xì)胞比例 <1%（1,000 個細(xì)胞中）。
整合	可同時檢測單個細(xì)胞的 mRNA 水平與蛋白水平。

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文庫結(jié)構(gòu)

圖 BD Rhapsody 基因表達(dá)文庫示意圖

 

  建議測序深度及參數(shù)

指標(biāo)	參數(shù)
測序深度	50,000~100,000 reads/cell
測序類型	PE150

 

1、類型：新鮮組織，原代細(xì)胞，細(xì)胞系等。

2、來源：血液提取、磁珠富集、流式富集、組織解離等。

3、樣本量及其它質(zhì)控要求：

樣本類型	樣本質(zhì)控要求
細(xì)胞懸液	> 10*  目標(biāo)細(xì)胞個數(shù)（底限   10,000  個細(xì)胞）；
	活率 >80%；
	濃度 500-1,000 個細(xì)胞 /ul；
	細(xì)胞間無粘連（成團(tuán)率 <5%）；
	無大于 40um 的細(xì)胞碎片或其他顆粒物；
	不存在逆轉(zhuǎn)錄抑制劑和非細(xì)胞的核酸分子。
血液	EDTA  抗凝的全血（不可肝素抗凝），>5ml。
組織	0.3cm×0.3cm（不超過 0.5cm×0.5cm）的新鮮組織，4~5  塊。

 

4、保存運(yùn)輸：

（1）細(xì)胞懸液：建議現(xiàn)場制備，如要運(yùn)輸，建議使用伯豪生物自主研發(fā)的單細(xì)胞保護(hù)液，4°C 運(yùn)輸，48 小時內(nèi)送達(dá)伯豪生物實驗室。

（2）血液：EDTA 抗凝的全血，4°C 運(yùn)輸，2 小時內(nèi)送達(dá)伯豪生物實驗室；或提取 PBMC 后凍存，干冰運(yùn)輸。

（3）組織：建議使用伯豪生物自主研發(fā)的單細(xì)胞組織保護(hù)液，4°C 運(yùn)輸，48 小時內(nèi)送達(dá)伯豪生物實驗室。

 

 

圖 數(shù)據(jù)質(zhì)控及過濾

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圖 去除批次效應(yīng)

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圖 單細(xì)胞 RNA 測序細(xì)胞亞群注釋

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圖 單細(xì)胞 RNA 測序樣本間的細(xì)胞構(gòu)成差異

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圖 單細(xì)胞 RNA 測序 Marker 基因分析

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圖 單細(xì)胞 RNA 測序擬時序分析

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圖 單細(xì)胞 RNA 測序擬時序 GO 注釋

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圖 單細(xì)胞 RNA 測序擬時序分化轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

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圖 單細(xì)胞 RNA 測序細(xì)胞亞群的功能富集分析

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圖 單細(xì)胞 RNA 測序細(xì)胞亞群的功能富集在樣本間的差異

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圖 單細(xì)胞 RNA 測序樣本間的功能差異分析

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圖 細(xì)胞通訊網(wǎng)絡(luò)

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1、胚胎發(fā)育

人類胚胎發(fā)育早期僅能收集微量的胚胎細(xì)胞和干細(xì)胞，這對于了解控制胚胎發(fā)育的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是一個難題，利用單細(xì)胞 RNA-Seq 技術(shù)對轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析則克服了轉(zhuǎn)錄組分析對細(xì)胞數(shù)量要求的限制，近年來已有多篇相關(guān)報道。北京大學(xué)湯富酬教授課題組早在 2009 年就對單個小鼠卵裂球的進(jìn)行 RNA-Seq[4]，檢測到了比微陣列技術(shù)多 75%（5270）的表達(dá)基因，并且確定了 1753 個新的可變剪接位點。這種單細(xì)胞 mRNA- Seq 檢測將大大提高我們對單個細(xì)胞在哺乳動物發(fā)展中轉(zhuǎn)錄復(fù)雜性的分析能力，尤其是胚胎發(fā)育早期和干細(xì)胞這類在體內(nèi)罕見的細(xì)胞群。2013 年，他們又對 90 個處于不同發(fā)育階段的人類早期胚胎細(xì)胞以及 34 個胚胎干細(xì)胞進(jìn)行了詳盡的分析 [5]，檢測出了 22,687 個母源表達(dá)基因，其中包括 8,701 條長鏈非編碼 RNAs，相比于以往通過 microarray 檢測出的 9,735 個母源基因數(shù)量大大增加。研究還發(fā)現(xiàn)了 2,733 條新的 lncRNAs，其中許多只在特定的發(fā)育階段表達(dá)。此外，實驗還檢測到 1498 個基因在上胚層（Epiblast，EPI）和體外人類胚胎干細(xì)胞間存在差異表達(dá)，證實了 EPI 和 ESCs 具有顯著不同的轉(zhuǎn)錄組，有顯示差異性表達(dá)，從而解答了人類上胚層和體外干細(xì)胞之間的基因表達(dá)是否相同這一由來已久的問題。

圖 單細(xì)胞 RNA 測序應(yīng)用：早期胚胎的單細(xì)胞測序 [5]

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2、器官發(fā)育

發(fā)育是一個極其復(fù)雜的過程，器官發(fā)生涉及到多種細(xì)胞類型的協(xié)調(diào)作用，期間基因表達(dá)受到嚴(yán)密、精準(zhǔn)的調(diào)控，這一過程中的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制仍然亟需深入研究。心臟是哺乳動物在胚胎期先形成的功能器官之一。盡管已有對小鼠胚胎心臟發(fā)育的大量系統(tǒng)研究，但是人類與小鼠的心臟存在著很大差異。2019 年，湯富酬課題組和喬杰課題組合作，利用高精度單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對人類胚胎 5 周至 25 周心臟的 4000 多個單細(xì)胞進(jìn)行了系統(tǒng)的分析 [6]。該研究系統(tǒng)鑒定了人類胚胎期心臟的主要細(xì)胞類型，包括心肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、瓣膜細(xì)胞、心外膜細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞以及各種免疫細(xì)胞（包括肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T 細(xì)胞和 B 細(xì)胞）。隨著心臟發(fā)育進(jìn)展，心房、心室中的心肌細(xì)胞比例顯著下降，成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等非心肌細(xì)胞的比例逐漸上升，這說明在發(fā)育過程中成纖維細(xì)胞等非心肌類型細(xì)胞對心臟發(fā)育的作用可能越來越重要。此外，還發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞解剖位置特異性的基因表達(dá)特點，而這些特點在早至胚胎發(fā)育第 5 周時就已經(jīng)有明確顯現(xiàn)。此外，通過與已經(jīng)發(fā)表的小鼠心臟發(fā)育的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)比較，鑒定出一系列人類心臟發(fā)育過程中主要細(xì)胞類型特異表達(dá)的重要基因。該研究還發(fā)現(xiàn)人類與小鼠的心臟中心肌細(xì)胞是較為相似的細(xì)胞類型，而成纖維細(xì)胞等細(xì)胞類型的物種間差異較大，這為利用小鼠模型研究人類的心臟發(fā)育提供了參比標(biāo)準(zhǔn)。

圖 單細(xì)胞 RNA 測序應(yīng)用：臟發(fā)育過程中主要細(xì)胞類型的時空特征 [6]

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3、干細(xì)胞分化

造血干細(xì)胞（HSC）具有長期自我更新、分化成多種成熟血細(xì)胞的潛能。它起源于胚胎前體，包括生血內(nèi)皮細(xì)胞和造血干細(xì)胞前體（pre-HSCs）。2016 年，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院劉兵課題組利用 pre-HSCs 特異性的表面標(biāo)志，分離出高純度的 pre-HSCs。并針對 HSC 發(fā)育過程中具有代表性的 5 類細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，繪制了 HSC 發(fā)育過程的轉(zhuǎn)錄組圖譜，揭示了 pre-HSC 在轉(zhuǎn)錄活性、基因表達(dá)、代謝狀態(tài)、信號通路和轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)等方面的特征 [7]。發(fā)現(xiàn)并揭示 mTOR 信號通路在特異性調(diào)控 HSC 發(fā)育中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。此外，還發(fā)掘出 Pre-HSC 的 98 個特征基因。該研究為今后闡明 HSC 的體內(nèi)發(fā)育規(guī)律、發(fā)掘 HSC 的體外再生策略提供了可靠的理論依據(jù)和數(shù)據(jù)資源�；�于以上單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，課題組在 2019 年進(jìn)一步描繪出 HSC 發(fā)育全程的 lncRNA 動態(tài)表達(dá)圖譜，并鑒定到在 HSC 發(fā)育過程中重要的功能性 lncRNA 分子 [8]。本研究通過生物信息學(xué)分析篩選獲得一組潛在的功能性 lncRNA，并通過體外功能實驗發(fā)現(xiàn) 6 個可能在胚胎造血發(fā)育中發(fā)揮作用的 lncRNA。利用條件基因敲除研究策略，著重闡明了 lncRNA-H19 對于 AGM 區(qū) HSC 發(fā)生的重要作用。LncRNA-H19 的缺失使得重要造血轉(zhuǎn)錄因子（包括 Runx1 及 Spi1 等）的啟動子區(qū)域高甲基化并下調(diào)其表達(dá)，以致血管內(nèi)皮細(xì)胞向 pre-HSC 的轉(zhuǎn)化阻滯。

圖 單細(xì)胞 RNA 測序應(yīng)用：HSC 發(fā)育過程中的基因動態(tài)圖譜 [7]

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4、神經(jīng)科學(xué)

神經(jīng)科學(xué)是單細(xì)胞測序的另一個應(yīng)用領(lǐng)域，哺乳動物的大腦中有數(shù)十億個神經(jīng)元，每個神經(jīng)元可根據(jù)形態(tài)特征，電生理特性，分子標(biāo)記進(jìn)行歸類。在一群細(xì)胞中，單個神經(jīng)元特異性的信息就被稀釋了，少數(shù)細(xì)胞特異的基因表達(dá)則有可能無法檢測到。研究不同神經(jīng)元的表達(dá)模式能夠為我們提供更全的基因表達(dá)圖譜、甚至表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。而且，將單個神經(jīng)元的基因表達(dá)于神經(jīng)元的表型信息結(jié)合起來，還能幫助我們對神經(jīng)元進(jìn)行更加準(zhǔn)確和細(xì)致的分類。上海伯豪助力中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院神經(jīng)科學(xué)研究所張旭院士研究組，通過高覆蓋度的單細(xì)胞測序和以神經(jīng)元大小為參考的層次聚類，對小鼠背根神經(jīng)節(jié)初級感覺神經(jīng)元進(jìn)行了分類，又通過全細(xì)胞膜片鉗在體記錄結(jié)合單細(xì)胞 PCR 方法可檢測各類初級感覺神經(jīng)元對外周皮膚刺激的反應(yīng)。該工作通過高覆蓋的單細(xì)胞測序?qū)Τ跫壐杏X神經(jīng)元進(jìn)行了重新分類，并且建立了基因表達(dá)與在體功能的相互關(guān)系 [9]。

圖 單細(xì)胞 RNA 測序應(yīng)用：神經(jīng)元單細(xì)胞測序及亞群分類 [9]

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5、腫瘤微環(huán)境

腫瘤細(xì)胞能夠采用不同策略，使人體的免疫系統(tǒng)受到抑制，不能正常殺傷腫瘤細(xì)胞，上述過程被稱為免疫逃逸。免疫治療通過激活人體自身的免疫系統(tǒng)，恢復(fù)機(jī)體正常的抗腫瘤免疫反應(yīng)，從而控制與清除腫瘤。其中抗程序性死亡蛋白 1（programmed death 1, PD-1）及其配體（PD-L1）抑制劑是目前研究較多，發(fā)展較快的一種免疫療法。在各種腫瘤中，接受 PD-1 /PD-L1 抑制劑單藥治療患者的客觀有效率也僅為 10-30%，大部分患者對免疫檢查抑制劑并不敏感。隨著研究的深入，人們逐漸了解到腫瘤微環(huán)境的復(fù)雜性和多樣性，以及它對免疫治療的重要影響。腫瘤微環(huán)境與腫瘤細(xì)胞相互作用，共同介導(dǎo)了腫瘤的免疫耐受，從而影響了免疫治療的效果�？鼓[瘤免疫應(yīng)答是由眾多免疫細(xì)胞和分子參與的復(fù)雜過程，受到機(jī)體復(fù)雜而精細(xì)的調(diào)控，這其中的機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。2017 年 6 月，北京大學(xué)張澤民課題組及其合作在 Cell 雜志發(fā)表了肝癌 T 細(xì)胞圖譜研究 [10]，研究總共獲得 5063 個單細(xì)胞的數(shù)據(jù)，總共聚類為 11 個 T 細(xì)胞亞群，包括  5 個 CD8+ T 細(xì)胞亞群和 6 個 CD4+ T 細(xì)胞亞群。其中肝癌組織中侵潤 Tregs 細(xì)胞亞群（C8_CD4-CTLA4）和耗竭性 CD8 T 細(xì)胞亞群（C4_CD8-LAYN）顯著富集，并且在這兩類細(xì)胞中表達(dá)的 PDCD1 和  TIGIT 等，是免疫治療的靶點。在腫瘤侵潤性 Tregs 中，共鑒定出 401 個特異表達(dá)基因，在耗竭性 CD8 T 細(xì)胞中，鑒定出 82 個特異表達(dá)基因，并且發(fā)現(xiàn)了新的耗竭 maker，如 LAYN，PHLDA1 和 SNAP47 等。值得注意的是，其中 22 個耗竭 marker 同時也在腫瘤侵潤性 Tregs 細(xì)胞中高表達(dá)，例如 CTLA4 和 LAYN 等。并且利用 TCGA 的數(shù)據(jù)進(jìn)行生存分析，發(fā)現(xiàn) LAYN 的表達(dá)顯著降低生存期。本研究還在單細(xì)胞水平進(jìn)行了 TCR 測序和分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在腫瘤侵潤的 exhausted T 細(xì)胞和 Tregs 細(xì)胞中，觀察到 TCRs 發(fā)生了重復(fù)使用。在腫瘤組織中含有相同 TCR 的 T 細(xì)胞比例較高，而在外周血和正常組織中比例較低，這說明在腫瘤中的 exhausted T 細(xì)胞和 Tregs 細(xì)胞發(fā)生了克隆擴(kuò)增。并且相比于早期病人，晚期病人中 T 細(xì)胞的克隆擴(kuò)增更加明 顯。本研究為腫瘤免疫的圖譜勾畫做出了范式，也為今后其他腫瘤開展類似的研究及各類腫瘤免疫的發(fā)展提供基礎(chǔ)。

圖 單細(xì)胞 RNA 測序應(yīng)用：肝癌患者的單細(xì)胞測序 [10]

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6、用藥指導(dǎo)

藥物誘發(fā)的超敏綜合癥（DiHS/DRESS）是一種致命的多器官炎癥性疾病，與皰疹病毒再激活和誘發(fā)的自身免疫性疾病相關(guān)。病理生理學(xué)仍然不清楚，臨床治療的選擇有限。2020 年 1 月發(fā)表在 Nature Medicine 上研究對 DiHS/DRESS 患者的皮膚和血液進(jìn)行了 scRNA-seq 檢測 [11]。皮膚活檢組織通過單細(xì)胞 RNAseq 發(fā)現(xiàn)，患者對比健康人差異表達(dá)基因數(shù)量較多的是淋巴細(xì)胞群體。分析皮膚活檢的淋巴細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)患者淋巴細(xì)胞呈現(xiàn)不同的分群�；颊吡馨图�(xì)胞中高表達(dá)的代表性基因有 CCR10，JAK3，STAT1 等。

圖 單細(xì)胞 RNA 測序應(yīng)用：患者皮膚活檢的淋巴細(xì)胞呈現(xiàn)不同的分群 [11]

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血液 PBMCs 細(xì)胞通過單細(xì)胞測序發(fā)現(xiàn)，患者對比健康人差異表達(dá)基因數(shù)量較多的是 CD4 和 CD8 陽性的亞型細(xì)胞和增殖的細(xì)胞。比較血液 PBMCs 在患者和健康人中的細(xì)胞群體分布，發(fā)現(xiàn) CCR4 和 CCR10（免疫細(xì)胞皮膚歸巢趨化因子受體）高表達(dá)的 CD4 和 CD8 陽性細(xì)胞在患者中顯著高于健康人。在患者的這個細(xì)胞群體中，表達(dá) JAK3，STAT1，IL2RG 等基因的細(xì)胞比例明 顯高于健康人。

圖 單細(xì)胞 RNA 測序應(yīng)用：患者血液的 CD4 和 CD8 細(xì)胞呈現(xiàn)不同的分群 [11]

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給予患者 JAK 抑制劑（tofacitinib）和口服抗皰疹病毒抑制劑（valganciclovir）后，患者的癥狀得到了極大的臨床獲益。治療前后的血液 PBMCs 細(xì)胞再次經(jīng)過單細(xì)胞 RNAseq 檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞群體分布明 顯分化。體外實驗也證實 JAK 抑制劑（tofacitinib）和抗病毒藥物（Ganciclovir 和 Artesunate）能夠有效抑制藥物（SMX-TMP）誘導(dǎo)的 T 細(xì)胞增殖。

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7、病毒感染

2020 年 1 月，整個中國因新型冠狀病毒 2019-nCov 得了一場“感冒”。疫情一開始，武漢病毒研究所石正麗團(tuán)隊就用實驗證實了血管緊張素轉(zhuǎn)化酶 2（Angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）是新型冠狀病毒感染人體的受體基因。2020 年 1 月 26 日，上海同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院左為研究團(tuán)隊在《bioRxiv》上發(fā)表了題為“Single-cell RNA expression profiling of ACE2, the putative receptor of Wuhan 2019-nCov”的文章 [12]。

該研究利用已有的數(shù)據(jù)庫，結(jié)合單細(xì)胞 RNA 測序技術(shù)中相關(guān)生信分析，對 ACE2 在人肺內(nèi)單個細(xì)胞的表達(dá)情況進(jìn)行了分析，共涉及 8 個樣本，43134 個細(xì)胞。結(jié)果表明：ACE2 受體主要在一部分（1% 左右）II 型肺泡上皮細(xì)胞（AT2）中表達(dá)；同時發(fā)現(xiàn)這些 AT2 細(xì)胞除了表達(dá)病毒受體，還表達(dá)與病毒復(fù)制和傳播相關(guān)的基因，說明其很可能是冠狀病毒的靶細(xì)胞�？梢�，單細(xì)胞測序技術(shù)不僅是科研的利器，同時還為破解疫情做了應(yīng)有的貢獻(xiàn)。

圖 單細(xì)胞 RNA 測序應(yīng)用：ACE2 和其它 marker 基因在細(xì)胞亞群中的表達(dá) [12]

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[12] Yu Zhao, Zixian Zhao, Yujia Wang, et al. Single-cell RNA expression profiling of ACE2, the putative receptor of Wuhan 2019-nCov. bioRxiv 2020.

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