蛋白提取
用TBS緩沖液潤洗貼壁細胞2-3次,最后一次盡量吸干殘留液。加入適當體積的細胞總蛋白提取試劑(使用前數分鐘內加入蛋白酶抑制劑)于培養(yǎng)板/瓶內裂解3-5min。期間反復晃動培養(yǎng)板/瓶,使試劑與細胞充分接觸。用細胞刮刀將細胞及試劑刮下,收集到1.5mL離心管中。冰浴30min,期間用移液器反復吹打,確保細胞完全裂解。4℃13000g離心5min,收集上清,即為總蛋白溶液。
低速離心收集細胞,加入適當體積的冷卻的PBS緩沖液重懸,2000rpm離心10 min,吸除上清。重復以上操作兩次,收集細胞沉淀。加入適當體積的細胞總蛋白提取試劑(使用前數分鐘內加入蛋白酶抑制劑),振蕩。冰浴30min,期間用移液器反復吹打,確保細胞完全裂解。4℃13000g離心5min,收集上清,即為總蛋白溶液。
組織塊用預冷的PBS緩沖液漂洗2-3次,去除血污,剪成小塊置于勻漿器中。加入10倍于組織體積的組織蛋白提取試劑(使用前數分鐘內加入蛋白酶抑制劑),冰浴徹底勻漿。將勻漿液轉移至離心管中,振蕩。冰浴30min,期間用移液器反復吹打,確保勻漿液完全裂解。4℃13000g離心5min,收集上清,即為總蛋白溶液。
收集細胞,將細胞重懸于適當體積的漿蛋白提取試劑(使用前數分鐘內加入蛋白酶抑制劑)中,振蕩混勻15 秒,使細胞完全懸浮并分散開。如果細胞沉淀沒有完全懸浮并分散開,可以適當延長振蕩混勻時間。冰浴30 min。高速振蕩混勻5 秒,4℃13000g 離心10 min。吸取上清至一預冷的離心管中,即為細胞漿蛋白。吸盡上清(上清盡量去凈,避免漿蛋白污染),加入適當體積的核蛋白提取試劑(使用前數分鐘內加入蛋白酶抑制劑),高速振蕩混勻15 秒,使沉淀完全懸浮并分散開。冰浴30min,每隔5min劇烈振蕩混勻10~20s, 4℃13000g離心10 min。吸取上清至一預冷的離心管中,即為細胞核蛋白。
使用BCA蛋白質濃度測定試劑盒測定樣品蛋白濃度。
1)樣品處理
①根據樣品濃度確定上樣量,保證每個樣品總蛋白上樣量均為40μg。
②在蛋白樣品中加入適當量的5×蛋白上樣緩沖液,95-100℃沸水浴5min。
2)制膠與上樣
① 配制分離膠(見附錄1),加入TEMED后立即搖勻灌膠。在膠面上緩慢加入適量水以壓平膠面,約45min后倒去膠上層水并用吸水紙將剩余水吸干。
② 配制濃縮膠(見附錄2),加入TEMED后立即搖勻灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。
③ 拔出梳子,將電泳架放入電泳槽中,加入電泳緩沖液,將樣品加入點樣孔中。
④ 按濃縮膠80V、分離膠120V進行恒壓電泳,至溴酚藍到達膠板下沿。
1)準備轉膜濾紙和PVDF膜,PVDF膜在使用之前先用甲醇活化。
2)按照正負極的方向擺放轉膜“三明治”結構,從正極到負極依次為轉膜海綿、3層濾紙、PVDF膜、膠、3層濾紙、轉膜海綿,擺放過程中要除盡各層中氣泡。
3)按300mA恒流轉膜,轉膜時間根據目的蛋白分子量大小調整。
1)將轉好的膜加入封閉液室溫封閉1h。
2)除去封閉液,加入已稀釋好的一抗4℃過夜。
3)回收已稀釋的一抗,用TBST洗三次,每次5min
4)加入稀釋好的二抗,室溫孵育30min,用TBST在室溫下搖床上洗四次,每次5min。
1)滴加新鮮配制的ECL混合溶液到膜的蛋白面?zhèn),暗室中曝光?br />
2)根據不同的光強度調整曝光條件,顯影、定影。
將膠片進行掃描存檔,AlphaEaseFC軟件處理系統(tǒng)分析目標帶的光密度值
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