WB服務(wù)

蛋白提取

• 貼壁細(xì)胞總蛋白提�。�

用TBS緩沖液潤洗貼壁細(xì)胞2-3次，最后一次盡量吸干殘留液。加入適當(dāng)體積的細(xì)胞總蛋白提取試劑（使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑）于培養(yǎng)板/瓶內(nèi)裂解3-5min。期間反復(fù)晃動培養(yǎng)板/瓶，使試劑與細(xì)胞充分接觸。用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞及試劑刮下，收集到1.5mL離心管中。冰浴30min，期間用移液器反復(fù)吹打，確保細(xì)胞完全裂解。4℃13000g離心5min，收集上清，即為總蛋白溶液。

• 懸浮細(xì)胞總蛋白提�。�

低速離心收集細(xì)胞，加入適當(dāng)體積的冷卻的PBS緩沖液重懸，2000rpm離心10 min，吸除上清。重復(fù)以上操作兩次，收集細(xì)胞沉淀。加入適當(dāng)體積的細(xì)胞總蛋白提取試劑（使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑），振蕩。冰浴30min，期間用移液器反復(fù)吹打，確保細(xì)胞完全裂解。4℃13000g離心5min，收集上清，即為總蛋白溶液。

• 組織總蛋白提�。�

組織塊用預(yù)冷的PBS緩沖液漂洗2-3次，去除血污，剪成小塊置于勻漿器中。加入10倍于組織體積的組織蛋白提取試劑（使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑），冰浴徹底勻漿。將勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管中，振蕩。冰浴30min，期間用移液器反復(fù)吹打，確保勻漿液完全裂解。4℃13000g離心5min，收集上清，即為總蛋白溶液。

• 胞漿胞核蛋白提�。�

收集細(xì)胞，將細(xì)胞重懸于適當(dāng)體積的漿蛋白提取試劑（使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑）中，振蕩混勻15 秒，使細(xì)胞完全懸浮并分散開。如果細(xì)胞沉淀沒有完全懸浮并分散開，可以適當(dāng)延長振蕩混勻時間。冰浴30 min。高速振蕩混勻5 秒，4℃13000g 離心10 min。吸取上清至一預(yù)冷的離心管中，即為細(xì)胞漿蛋白。吸盡上清（上清盡量去凈，避免漿蛋白污染），加入適當(dāng)體積的核蛋白提取試劑（使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑），高速振蕩混勻15 秒，使沉淀完全懸浮并分散開。冰浴30min，每隔5min劇烈振蕩混勻10～20s， 4℃13000g離心10 min。吸取上清至一預(yù)冷的離心管中，即為細(xì)胞核蛋白。

• 蛋白濃度定量

使用BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒測定樣品蛋白濃度。

• SDS-PAGE電泳

1）樣品處理
①根據(jù)樣品濃度確定上樣量，保證每個樣品總蛋白上樣量均為40μg。
②在蛋白樣品中加入適當(dāng)量的5×蛋白上樣緩沖液，95-100℃沸水浴5min。
2）制膠與上樣
① 配制分離膠（見附錄1），加入TEMED后立即搖勻灌膠。在膠面上緩慢加入適量水以壓平膠面，約45min后倒去膠上層水并用吸水紙將剩余水吸干。
② 配制濃縮膠（見附錄2），加入TEMED后立即搖勻灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。
③ 拔出梳子，將電泳架放入電泳槽中，加入電泳緩沖液，將樣品加入點樣孔中。
④ 按濃縮膠80V、分離膠120V進(jìn)行恒壓電泳，至溴酚藍(lán)到達(dá)膠板下沿。

• 轉(zhuǎn)膜

1）準(zhǔn)備轉(zhuǎn)膜濾紙和PVDF膜，PVDF膜在使用之前先用甲醇活化。
2）按照正負(fù)極的方向擺放轉(zhuǎn)膜“三明治”結(jié)構(gòu)，從正極到負(fù)極依次為轉(zhuǎn)膜海綿、3層濾紙、PVDF膜、膠、3層濾紙、轉(zhuǎn)膜海綿，擺放過程中要除盡各層中氣泡。
3）按300mA恒流轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜時間根據(jù)目的蛋白分子量大小調(diào)整。

• 抗體孵育

1）將轉(zhuǎn)好的膜加入封閉液室溫封閉1h。
2）除去封閉液，加入已稀釋好的一抗4℃過夜。
3）回收已稀釋的一抗，用TBST洗三次，每次5min
4）加入稀釋好的二抗，室溫孵育30min，用TBST在室溫下?lián)u床上洗四次，每次5min。

• 化學(xué)發(fā)光檢測

1）滴加新鮮配制的ECL混合溶液到膜的蛋白面?zhèn)�，暗室中曝光�?br /> 2）根據(jù)不同的光強度調(diào)整曝光條件，顯影、定影。

• 結(jié)果分析

將膠片進(jìn)行掃描存檔，AlphaEaseFC軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值