CO-IP

1、蛋白提取
1）貼壁細(xì)胞總蛋白提�。�
用PBS緩沖液潤(rùn)洗貼壁細(xì)胞2-3次，最后一次盡量吸干殘留液。加入適當(dāng)體積的IP裂解液（使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑）于培養(yǎng)板/瓶?jī)?nèi)裂解3-5min。期間反復(fù)晃動(dòng)培養(yǎng)板/瓶，使試劑與細(xì)胞充分接觸。用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞及試劑刮下，收集到1.5mL離心管中。冰浴30min，期間用移液器反復(fù)吹打，確保細(xì)胞完全裂解。4℃12000rpm離心5min，收集上清，取上清1/10作為Input，剩余樣本做IP。
2）懸浮細(xì)胞總蛋白提取：
低速離心收集細(xì)胞，加入適當(dāng)體積的冷卻的PBS緩沖液重懸，2000rpm離心10 min，吸除上清。重復(fù)以上操作兩次，收集細(xì)胞沉淀。加入適當(dāng)體積的IP裂解液（使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑），振蕩。冰浴30min，期間用移液器反復(fù)吹打，確保細(xì)胞完全裂解。4℃12000rpm離心5min，收集上清，取上清1/10作為Input，剩余樣本做IP。
3）組織總蛋白提�。�
組織塊用預(yù)冷的PBS緩沖液漂洗2-3次，去除血污，剪成小塊置于勻漿器中。加入10倍于組織體積的IP裂解液（使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑），冰浴徹底勻漿。將勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管中，振蕩。冰浴30min，期間用移液器反復(fù)吹打，確保勻漿液完全裂解。4℃12000rpm離心5min，收集上清，取上清1/10作為Input，剩余樣本做IP。

• 蛋白濃度定量

使用BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定樣品蛋白濃度。

• 磁珠預(yù)處理

取20μl磁珠加入適當(dāng)體積的IP裂解液于離心管中，置于垂直搖床上洗滌5min后，將離心管置于磁力架上靜置5-10s,吸掉上清（盡量避免碰到磁珠）。

• 裂解液預(yù)處理

向細(xì)胞裂解液上清或者組織裂解上清中加入1.0μg IgG（與COIP實(shí)驗(yàn)用于沉淀的抗體種屬來源相同的普通IgG）和20μl磁珠（使用前充分混勻），4℃搖轉(zhuǎn)孵育30min。

• IP過程

• 取以上相同量細(xì)胞裂解液或者組織裂解液上清1到1.5ml離心管中，加入1-10μL（0.2-2μg）抗體沉淀兩種相互作用的蛋白質(zhì)中的一種（同時(shí)加相同量的與用于沉淀的抗體種屬來源相同的普通IgG作為陰性對(duì)照，陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)），然后4℃孵育1h；（一般加入1.0μg沉淀抗體，具體沉淀抗體加入量根據(jù)IP級(jí)抗體使用說明書進(jìn)行稀釋）。
• 再加入20μl磁珠（使用前充分混勻），用手指輕輕彈勻，4℃搖轉(zhuǎn)孵育過夜；
• 將離心管置于磁力架上靜置5-10s,吸掉上清（盡量避免碰到磁珠）。
• 加入適當(dāng)體積的Washing buffer 于離心管中，置于垂直搖床上洗滌3min后，將離心管置于磁力架上靜置5-10s,吸掉上清（盡量避免碰到磁珠）。
• 重復(fù)④操作3次。
• 最后一次洗滌之后，小心棄去上清后，加入適當(dāng)體積 2×SDS含巰基乙醇的上樣緩沖液，沸水煮10min，樣本置于-20℃保存。

• SDS-PAGE電泳

制膠與上樣
① 配制分離膠（見附錄1），加入TEMED后立即搖勻灌膠。在膠面上緩慢加入適量水以壓平膠面，約45min后倒去膠上層水并用吸水紙將剩余水吸干。
② 配制濃縮膠（見附錄2），加入TEMED后立即搖勻灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。
③ 拔出梳子，將電泳架放入電泳槽中，加入電泳緩沖液，將樣品加入點(diǎn)樣孔中。
④ 按濃縮膠80V、分離膠120V進(jìn)行恒壓電泳，至溴酚藍(lán)到達(dá)膠板下沿。

• 轉(zhuǎn)膜

1）準(zhǔn)備轉(zhuǎn)膜濾紙和PVDF膜，PVDF膜在使用之前先用甲醇活化。
2）按照正負(fù)極的方向擺放轉(zhuǎn)膜“三明治”結(jié)構(gòu)，從正極到負(fù)極依次為轉(zhuǎn)膜海綿、3層濾紙、PVDF膜、膠、3層濾紙、轉(zhuǎn)膜海綿，擺放過程中要除盡各層中氣泡。
3）按300mA恒流轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜時(shí)間根據(jù)目的蛋白分子量大小調(diào)整。

• 抗體孵育

1）將轉(zhuǎn)好的膜加入封閉液室溫封閉1h。
2）除去封閉液，加入已稀釋好的一抗4℃過夜。
3）回收已稀釋的一抗，用TBST洗三次，每次5min
4）加入稀釋好的二抗，室溫孵育30min，用TBST在室溫下?lián)u床上洗四次，每次5min。

• 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)

1）滴加新鮮配制的ECL混合溶液到膜的蛋白面?zhèn)龋�暗室中曝光�?br /> 2）根據(jù)不同的光強(qiáng)度調(diào)整曝光條件，顯影、定影。 

• 結(jié)果分析

將膠片進(jìn)行掃描存檔，AlphaEaseFC軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值。