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實時熒光定量PCR
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二、操作步驟
三、附錄
1、數(shù)據(jù)分析方法
ΔΔCT法：
A=CT(目的基因，實驗樣本)- CT(內(nèi)標基因，實驗樣本)
B=CT(目的基因，對照樣本)- CT(內(nèi)標基因，對照樣本)
K=A-B
表達倍數(shù)=2-K
2、引物
（1）引物由武漢金開瑞生物工程有限公司合成
（2）序列如下：
| 1、RNA提取 對于貼壁細胞樣本 （1）用移液器小心吸去培養(yǎng)基，加入1mL 4℃預冷的PBS溶液，小心搖晃洗去殘余培養(yǎng)基，用移液器吸盡PBS溶液，加入1mL Trizol溶液，反復吹打培養(yǎng)瓶/培養(yǎng)基底部及四周，將細胞充分吹打到Trizol中。加入250μL三氯甲烷，充分混勻，冰上靜置5min。 （2）混合液4℃，10000g，10min離心。超凈工作臺中小心吸取上清500μL于1.5mL EP管中，加入等體積4℃預冷的異丙醇，顛倒混勻，-20℃靜置15min。 （3）溶液4℃，10000g，10min離心，小心倒掉液體，加入1mL 4℃預冷的75%乙醇，顛倒數(shù)次，清洗RNA沉淀，4℃，10000g，5min離心，倒掉液體，于超凈工作臺中干燥數(shù)分鐘，將乙醇充分揮發(fā)干凈，加入10μL RNase-Free Water，充分溶解RNA。 對于懸浮細胞樣本 （1）低速離心收集細胞，加入適當體積的冷卻的PBS緩沖液重懸，300g離心10 min，吸除上清。重復以上操作兩次，收集細胞沉淀。加入1mL Trizol溶液，反復吹打?qū)⒓毎浞执荡虻絋rizol中加入250μL三氯甲烷，充分混勻，冰上靜置5min。 （2）混合液4℃，10000g，10min離心。超凈工作臺中小心吸取上清500μL于1.5mL EP管中，加入等體積4℃預冷的異丙醇，顛倒混勻，-20℃靜置15min。 （3）溶液4℃，10000g，10min離心，小心倒掉液體，加入1mL 4℃預冷的75%乙醇，顛倒數(shù)次，清洗RNA沉淀，4℃，10000g，5min離心，倒掉液體，于超凈工作臺中干燥數(shù)分鐘，將乙醇充分揮發(fā)干凈，加入10μL RNase-Free Water，充分溶解RNA。 對于組織樣本 （1）標本于-80℃或液氮中保存，用已經(jīng)消毒的工具于冰上取約100mg組織，于1mL 預冷的Trizol中充分研磨，勻漿液小心倒入1.5mL EP管中，加入250μL三氯甲烷，充分混勻，冰上靜置5min。 （2）混合液4℃，10000g，10min離心。超凈工作臺中小心吸取上清500μL 于1.5mL EP管中，加入等體積4℃預冷的異丙醇，顛倒混勻，-20℃靜置15min。 （3）溶液4℃，10000g，10min離心，小心倒掉液體，加入1mL 4℃預冷的75%乙醇，顛倒數(shù)次，清洗RNA沉淀，4℃，10000g，5min離心，倒掉液體，于超凈工作臺中干燥數(shù)分鐘，將乙醇充分揮發(fā)干凈，加入10μL RNase-Free Water，充分溶解RNA。 對于血液樣本 （1）取500μL全血于15mL離心管中，加入10倍體積紅細胞裂解液，混勻，室溫避光靜置10min。 （2）室溫，300g，離心10min，棄上清，重復步驟（1），室溫，300g，離心10min，棄上清。 （3）PBS重懸細胞沉淀，室溫，300g，離心10min，棄上清，100μL PBS重懸細胞，加入1mL Trizol，混勻，靜置5min，加入250μL三氯甲烷，充分混勻，冰上靜置5min。 （4）混合液4℃，10000g，10min離心。超凈工作臺中小心吸取上清500μL 于1.5mL EP管中，加入等體積4℃預冷的異丙醇，顛倒混勻，-20℃靜置15min。 （5）溶液4℃，10000g，10min離心，小心倒掉液體，加入1mL 4℃預冷的75%乙醇，顛倒數(shù)次，清洗RNA沉淀，4℃，10000g，5min離心，倒掉液體，于超凈工作臺中干燥數(shù)分鐘，將乙醇充分揮發(fā)干凈，加入10μL RNase-Free Water，充分溶解RNA。 2、第一鏈cDNA合成 第一鏈cDNA的合成采用PrimeScript™RT reagent Kit with gDNA Eraser進行（TaKaRa公司），主要步驟如下： （1）在冰上配置如下反應(yīng)液，以除去基因組DNA。
 PCR儀上42℃ 2 min 4℃ （2）在冰上配置如下反應(yīng)液
 PCR儀上37℃ 15 min 85℃ 5 sec 4℃ 3、熒光定量PCR 實時熒光定量PCR是在Life technologies公司的StepOne™ Real-Time PCR儀上完成，每個樣品均作3個復孔，使用SYBR® Premix Ex Taq™試劑盒進行（TaKaRa公司）： （1）反應(yīng)程序為：預變性 95℃，1min 循環(huán)（40次） 95℃，15s→58℃，20s→72℃，45s 熔解曲線 60℃→95℃，每20s升溫1℃ （2）反應(yīng)體系為：
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1、數(shù)據(jù)分析方法
ΔΔCT法：
A=CT(目的基因，實驗樣本)- CT(內(nèi)標基因，實驗樣本)
B=CT(目的基因，對照樣本)- CT(內(nèi)標基因，對照樣本)
K=A-B
表達倍數(shù)=2-K
2、引物
（1）引物由武漢金開瑞生物工程有限公司合成
（2）序列如下：
| 引物名稱 | 引物序列 | 產(chǎn)物長度（bp） | |
| Forward | 5`--3` | ||
| reverse | 5`--3` | ||
| 5`--3` | |||
| 5`--3` | |||
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