透射電鏡（TEM）

概念
透射電子顯微鏡(Transmission Electron Microscope,簡稱TEM),可以看到在光學(xué)顯微鏡下無法看清的小于0.2um的細(xì)微結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)稱為亞顯微結(jié)構(gòu)或超微結(jié)構(gòu)。要想看清這些結(jié)構(gòu)，就必須選擇波長更短的光源，以提高顯微鏡的分辨率
原理
透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）是利用陰極發(fā)射的電子，通過陽極中央的微孔形成的電子束穿透樣品獲得樣品的電子信號，經(jīng)物鏡、中間鏡和投影鏡等多級電子放大至數(shù)百至數(shù)千萬倍，最后成像在熒光屏上便可即時觀察，或是投射到照相底片感光片上作為永久記錄。目前TEM的分辨力可達(dá)0.2 nm。
由于標(biāo)本必須置于高真空中進(jìn)行電鏡觀察，所以電鏡觀察的生物標(biāo)本必須特殊制備，不能含水，離體的生物標(biāo)本要迅速加以固定，以防產(chǎn)生結(jié)構(gòu)改變。另外，電子的穿透力很弱，這就需要把樣品制成50 nm～100 nm厚的超薄切片（一個細(xì)胞切成100～200片）。為了使柔軟的生物組織能夠制成這樣薄的切片，并使切片耐受高真空和電子轟擊，所以在切片前要進(jìn)行包埋。超薄切片技術(shù)是透射電鏡觀察成功的關(guān)鍵。
實(shí)驗(yàn)流程
取材及戊二醛固定→漂洗→鋨酸固定→漂洗→丙酮梯度脫水→滲透→包埋→切片→雙染色→電鏡觀察及拍照
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
 
注意事項(xiàng)

• 取材

• 快：實(shí)驗(yàn)標(biāo)本在動物麻醉或處死后1~2分鐘內(nèi)取材、固定完畢；臨床活檢標(biāo)本力爭組織離體后1分鐘內(nèi)固定。固定液為預(yù)冷的2.5%緩沖戊二醛固定液。
• �。弘婄R標(biāo)本的標(biāo)準(zhǔn)大小為1mm3。取材時，可先取稍大組織，經(jīng)稍許時間的預(yù)固定后，再改小。
• 利：切割組織時，需用鋒利的手術(shù)刀片、雙面刀片劃取，避免揉割、牽拉和擠壓組織，防止機(jī)械損傷。禁止使用剪刀剪切。
• 凈：取材所用器皿，應(yīng)事先清洗干凈并烘干。
• 冷：取材可在常溫下進(jìn)行。如有條件最好在4℃低溫下操作，以減少組織自溶。所用器械、容器及固定液均應(yīng)預(yù)冷。
• 所取標(biāo)本做好標(biāo)記：瓶簽上注明組別、編號等。
• 取材部位應(yīng)準(zhǔn)確：根據(jù)觀察內(nèi)容和實(shí)驗(yàn)?zāi)康�，精�?zhǔn)取材，如腫瘤取材時，應(yīng)確保取到腫瘤實(shí)質(zhì)，避免取腫瘤間質(zhì)或出血、壞死部位。

 

• 固定

預(yù)固定：2.5%緩沖戊二醛固定液，用量應(yīng)為10~20倍于組織塊的體積，4℃固定至少30min以上。
取適量0.1mol/L PBS緩沖液清洗3次，每次10min。
后固定：1%鋨酸固定，腎臟固定4min，其他組織固定1h。
取適量0.1mol/L PBS緩沖液清洗3次，每次10min。
 
 
 

• 培養(yǎng)細(xì)胞的取材和固定細(xì)胞樣本做透射電鏡處理辦法與保存條件
  1．常規(guī)收集帖壁和懸浮細(xì)胞，置離心管中離心，800～1000r/min，10min。
  2．用0.01mol/L PBS 5ml重懸細(xì)胞。
  3．將細(xì)胞懸液吸入有瓊脂空槽的離心管中。
  4．離心，2000r/min，15～20min，使細(xì)胞成團(tuán)。
  5．小心吸去上清，加入2.5％戊二醛固定液固定細(xì)胞團(tuán)，以免細(xì)胞團(tuán)散開。
  6．取出離心管內(nèi)的瓊脂，仔細(xì)切下尖槽內(nèi)含有細(xì)胞團(tuán)的瓊脂塊。
  7．將含細(xì)胞的團(tuán)瓊脂塊投入含戊二醛固定液的小瓶中，4℃（可長期）保存。
  8．用0.1mol/L PBS緩沖液洗1次。
  9．1％鋨酸后固定30～60min。