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同源重組方法
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同源重組方法（及基因敲除小鼠）
如果研究者想用基因工程載體代替其等位基因，同時(shí)又不會對基因組上的其他基因造成任何影響，那么最好的選擇就是進(jìn)行同源重組。要進(jìn)行這一操作，首先要知道靶基因的DNA序列（如圖1）。有了這一信息，用你的目標(biāo)序列替換任何靶基因就都成為可能。關(guān)于同源重組的方法，除本章圖解外還有更多的細(xì)節(jié)，這里只介紹基本的原理。
圖1 需要被基因工程載體所替代的靶基因圖譜。編碼序列由方框標(biāo)出，其上下游側(cè)翼DNA序列也被標(biāo)明。由靶基因向兩側(cè)延伸的箭頭代表染色體上其他的連續(xù)DNA序列。
接下來的步驟就是設(shè)計(jì)并構(gòu)建DNA載體，用以插入并替代染色體上的等位基因。這一載體可以包含你所選擇的任何DNA序列，用來將不同的等位基因，即研究者所要插入的目標(biāo)序列（編碼區(qū)或非編碼區(qū)均可）或報(bào)告基因（例如：抗生素抗性基因或綠色熒光蛋白）插入基因組中。但不論插入哪種序列，都需要包含一些與靶基因上下游側(cè)翼序列一致的DNA序列（如圖2）.除了陽性篩選標(biāo)記（例如抗生素抗性基因），通常還需要在載體中加入陰性篩選標(biāo)記（例如胸苷激酶，tk）。通常陰性標(biāo)記位于載體上與靶基因同源的序列之外。
圖2 用于同源重組的基因工程載體圖譜。取代序列的上下游側(cè)翼序列與靶基因的上下游側(cè)翼序列一致。陰性篩選標(biāo)記tk位于載體上與靶基因同源的序列下游。
基因工程載體被加入到包含靶基因的細(xì)胞中。其替代等位基因的機(jī)理還不完全清楚，但是與細(xì)胞減數(shù)分裂和有絲分裂中同源染色體在細(xì)胞板處聯(lián)會非常相似，基因工程載體能夠找到靶基因并在與之相同的DNA序列處發(fā)生同源重組（如圖3）。這種重組可能發(fā)生在二者相同側(cè)翼序列的任何位置，但具體位置則由細(xì)胞本身決定，而不是人工能夠控制的。
圖3 同源重組發(fā)生前的載體與靶基因。令人驚奇的是，載體自身能夠進(jìn)入細(xì)胞核并與靶基因并排排列。這種排列的機(jī)制尚不清楚，但是在某些物種中，這種排列的確比其他物種中的更完美，酵母就是其中之一。小鼠是用于同源重組的較好的哺乳動物系統(tǒng)，但是其中重組發(fā)生的效率不如人類細(xì)胞高。
細(xì)胞發(fā)生同源重組后，新的DNA片段即目標(biāo)序列被插入了基因組中。其中只是靶基因及其上下游的一些側(cè)翼序列被載體中同源的部分所取代，基因組的其他部分并不受到影響（如圖4）。在載體與靶基因發(fā)生重組后，最初的靶基因序列被交換到了載體上。由于載體不能夠在細(xì)胞核中獨(dú)立地進(jìn)行復(fù)制，因此隨著細(xì)胞的分裂很快就丟失了。而被替代后的基因組則忠實(shí)地進(jìn)行自我復(fù)制，此時(shí)新插入的目標(biāo)序列也就得以復(fù)制了。
發(fā)生了同源重組的細(xì)胞（帶有陽性篩選標(biāo)記）可以用加入了特定抗生素的培養(yǎng)基篩選出來。需要注意的是，陰性篩選標(biāo)記并沒有通過同源重組整合到染色體中。
圖4 同源重組發(fā)生后的產(chǎn)物。此時(shí)染色體上的靶基因被載體攜帶的目標(biāo)序列所取代，同時(shí)還包括一些與載體一致的側(cè)翼序列。而靶基因則被交換到載體上，隨著細(xì)胞的分裂而丟失。自此，插入到基因組中的目標(biāo)序列就會像其他所有序列一樣，隨著基因組的復(fù)制而被忠實(shí)地復(fù)制。
如果載體與基因組上的非同源區(qū)域并排排列，就可能發(fā)生任意的非同源重組，此時(shí)載體上攜帶的陰性選擇標(biāo)記就會被整合到基因組中（如圖5）。
圖5非同源重組發(fā)生前的載體與靶基因。此時(shí)發(fā)生的重組是任意的。需要注意的是，在這種情況下，陰性篩選標(biāo)記被整合到了基因組中。
發(fā)生了非同源重組的細(xì)胞（如圖6）在陽性篩選標(biāo)記的特定抗性培養(yǎng)基中能夠存活。但是，有一種藥物叫做更昔韋洛（gancyclovir），能夠殺死任何攜帶有tk基因的細(xì)胞。因此，發(fā)生了同源重組的細(xì)胞就可以在抗生素與更昔韋洛同時(shí)存在的培養(yǎng)基中存活，而發(fā)生了非同源重組的細(xì)胞則會被更昔韋洛殺死。
圖6 非同源重組發(fā)生后的產(chǎn)物。陽性和陰性篩選標(biāo)記同時(shí)進(jìn)入細(xì)胞染色體，因此更昔韋洛能夠殺死發(fā)生了非同源重組的細(xì)胞。
基因敲除小鼠
基因敲除小鼠一對同源染色體上相同的等位基因都被失活基因取代。通常先利用同源重組的方法“修飾”一個(gè)等位基因，得到嵌合體小鼠；接著通過兩代或多代的選擇育種，選擇出等位基因完全被“修飾”而失活的純合小鼠。基因敲除小鼠使得研究者們能夠觀察到某一特定基因完全失活后小鼠表型的改變，從而推斷出特定基因的作用。
第一步，胚泡時(shí)期發(fā)育胚胎的分離。此胚胎來源于灰色品系的小鼠。
第二步，從灰色小鼠胚泡中分離胚胎干細(xì)胞，在體外進(jìn)行培養(yǎng)。
第三步，用同源重組載體轉(zhuǎn)染胚胎干細(xì)胞，用含有新霉素和更昔韋洛的培養(yǎng)基篩選發(fā)生了同源重組的細(xì)胞。
第四步，將篩選得到的胚胎干細(xì)胞植入白色小鼠的早期胚胎（胚泡時(shí)期）中。
第五步，將上述胚胎植入假孕母鼠（白色）子宮中。
第六步，在母鼠所產(chǎn)的小鼠中，有一些是正常的白色，另一些則是嵌合體灰白相間的小鼠。這些嵌合體小鼠的細(xì)胞一部分起源于白色皮毛的胚泡細(xì)胞，另一部分則起源于重組的胚胎干細(xì)胞。起源于重組胚胎干細(xì)胞的皮毛顯示出灰色斑塊，很好辨認(rèn)。
第七步，嵌合體小鼠與野生型白色小鼠進(jìn)行雜交，如果嵌合體小鼠的生殖細(xì)胞恰好是起源于重組胚胎干細(xì)胞，那么其子代小鼠就都應(yīng)該呈現(xiàn)灰色。而這些灰色小鼠的所有細(xì)胞都是雜合體。
第八步，雜合體灰色小鼠（+/H）之間進(jìn)行雜交，得到灰色和白色的子代。從灰色子代中篩選出純合小鼠（H/H），其一對同源染色體上的等位基因都失活，此純合小鼠即為 “基因敲除小鼠”。
我們有開發(fā)的基因敲除小鼠APOE(動脈硬化研究),
PEPT(白內(nèi)障研究)
Shh+/- 基因敲除小鼠等小鼠: Shh（Sonic hedgehog）基因在脊椎動物胚胎組織形成中起著重要的作用，包括大腦、脊椎、中軸骨骼和四肢的形成�；蛉笔У呐咛ピ缙诳梢杂^察到中間結(jié)構(gòu)如脊索和地板的形成和維持的影響，晚期可以觀察到遠(yuǎn)肢結(jié)構(gòu)的缺失以及獨(dú)眼，腹部細(xì)胞包括神經(jīng)管的缺失、脊柱和許多肋骨的缺失。Shh蛋白被證實(shí)是脊椎動物發(fā)育過程中組織形成所必須的胞外信號。
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