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條件性基因敲除小鼠模型構(gòu)建建立技術(shù)服務(wù) 中科院實(shí)驗(yàn)室
醫(yī)科利昊公司提供基因敲除小鼠服務(wù)、轉(zhuǎn)基因小鼠和基因打靶技術(shù)服務(wù),基因體內(nèi)功能研究提供穩(wěn)定可靠的技術(shù)平臺(tái)
服務(wù)類(lèi)別:轉(zhuǎn)基因總訪問(wèn):3644
最后更新:2020-7-23半年訪問(wèn):37
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利用基因打靶技術(shù)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)锏程序一般為(1) 構(gòu)建.基因打靶載體; (2) 將基因打靶載體通過(guò)一定的方式(常用電穿孔法) 導(dǎo)入同源的胚胎干細(xì)胞中,使外源DNA 與胚胎干細(xì)胞基因組中相應(yīng)部分發(fā)生同源重組,將打靶載體中的DNA 序列整合到內(nèi)源基因組中從而得以表達(dá); (3) 篩選發(fā)生同源重組的陽(yáng)性克隆,通過(guò)顯微注射或者胚胎凝集的方法將經(jīng)過(guò)遺傳修飾的ES細(xì)胞引入受體胚胎內(nèi)制作嵌合體小鼠,在生物活體中研究特定基因的功能;蚯贸∈笫沟醚芯空邆兡軌蛴^察到某一特定基因完全失活后小鼠表型的改變,從而推斷出特定基因的作用。
基因打靶的原則是, 外源DNA 片段含有與目的基因的某一段核酸序列相同或接近的同源序列, 同源重組就發(fā)生在這兩個(gè)序列之間。外源DNA 序列的定位整合有兩種方式,即插入型(又稱(chēng)O 型) 和置換型(又稱(chēng)8 型)。與此相對(duì)應(yīng),打靶載體可分為兩類(lèi): 插入型載體和置換型載體。
第一步,胚泡時(shí)期發(fā)育胚胎的分離。此胚胎來(lái)源于灰色品系的小鼠。


第二步,從灰色小鼠胚泡中分離胚胎干細(xì)胞,在體外進(jìn)行培養(yǎng)。
 

第三步,用同源重組載體轉(zhuǎn)染胚胎干細(xì)胞,用含有新霉素和更昔韋洛的培養(yǎng)基篩選發(fā)生了同源重組的細(xì)胞。

第四步,將篩選得到的胚胎干細(xì)胞植入白色小鼠的早期胚胎(胚泡時(shí)期)中。

第五步,將上述胚胎植入假孕母鼠(白色)子宮中。

第六步,在母鼠所產(chǎn)的小鼠中,有一些是正常的白色,另一些則是嵌合體灰白相間的小鼠。這些嵌合體小鼠的細(xì)胞一部分起源于白色皮毛的胚泡細(xì)胞,另一部分則起源于重組的胚胎干細(xì)胞。起源于重組胚胎干細(xì)胞的皮毛顯示出灰色斑塊,很好辨認(rèn)。

第七步,嵌合體小鼠與野生型白色小鼠進(jìn)行雜交,如果嵌合體小鼠的生殖細(xì)胞恰好是起源于重組胚胎干細(xì)胞,那么其子代小鼠就都應(yīng)該呈現(xiàn)灰色。而這些灰色小鼠的所有細(xì)胞都是雜合體。
第八步,雜合體灰色小鼠(+/H)之間進(jìn)行雜交,得到灰色和白色的子代。從灰色子代中篩選出純合小鼠(H/H),其一對(duì)同源染色體上的等位基因都失活,此純合小鼠即為 “基因敲除小鼠構(gòu)建”。
我們有開(kāi)發(fā)的基因敲除小鼠構(gòu)建APOE(動(dòng)脈硬化研究),

PEPT(白內(nèi)障研究)

Shh+/- 基因敲除小鼠構(gòu)建等小鼠: Shh(Sonic hedgehog)基因在脊椎動(dòng)物胚胎組織形成中起著重要的作用,包括大腦、脊椎、中軸骨骼和四肢的形成。基因缺失的胚胎早期可以觀察到中間結(jié)構(gòu)如脊索和地板的形成和維持的影響,晚期可以觀察到遠(yuǎn)肢結(jié)構(gòu)的缺失以及獨(dú)眼,腹部細(xì)胞包括神經(jīng)管的缺失、脊柱和許多肋骨的缺失。Shh蛋白被證實(shí)是脊椎動(dòng)物發(fā)育過(guò)程中組織形成所必須的胞外信號(hào)。

 
 
至善研究院提供轉(zhuǎn)基因和基因打靶技術(shù)服務(wù),基因體內(nèi)功能研究提供穩(wěn)定可靠的技術(shù)平臺(tái)。核心服務(wù)內(nèi)容包括載體構(gòu)建、基因工程小鼠制備和表型分析。
分子生物學(xué)服務(wù)
1)      轉(zhuǎn)基因載體          組織特異性啟動(dòng)子、廣泛表達(dá)基因上調(diào)與下調(diào)啟動(dòng)子、可控啟動(dòng)子及各種熒光標(biāo)記和抗藥性標(biāo)記
2)      siRNA載體          干擾序列設(shè)計(jì)、篩選或由客戶提供已挑選好的干擾序列
3)      打靶載體             基于Cre-loxP或 Flp-FRT技術(shù)的位點(diǎn)特異性重組
4)      表達(dá)載體/病毒載體  客戶需提供含有目的基因的質(zhì);騝DNA模板
5)      定點(diǎn)突變服務(wù)         客戶需提供原始質(zhì);駾N**斷的測(cè)序結(jié)果
6)      PCR產(chǎn)物克隆        將PCR產(chǎn)物(3’端加A)克隆至T載體
表型鑒定服務(wù)
1)      基于lacZ和GFP報(bào)告基因的發(fā)育和基因表達(dá)分析
2)      Northern blot 或western blot
3)      行為學(xué)表型分析
4)      免疫組化分析
5)      RT-PCR
 
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