質(zhì)粒純化方案中的關(guān)鍵步驟

如今質(zhì)粒純化不再是什么難題，那么做了這么次質(zhì)粒抽提的你了解質(zhì)粒純化的原理嗎？你知道哪些步驟對質(zhì)粒純化的成功起著關(guān)鍵作用嗎？

QIAGEN質(zhì)粒抽提簡單原理：

在堿性條件下裂解細(xì)菌之后，將裂解液以指定的鹽濃度加入QIAGEN-tip當(dāng)中。質(zhì)粒DNA將發(fā)生選擇性的結(jié)合而從RNA、蛋白質(zhì)及其他細(xì)胞污染物中被分離出來。

1、制備細(xì)胞裂解產(chǎn)物 

細(xì)胞產(chǎn)率很大程度上依賴于細(xì)胞裂解質(zhì)量。因此制備澄清的細(xì)胞裂解產(chǎn)物是QIAGEN純化方案中的重要一環(huán)，QIAGEN已經(jīng)仔細(xì)針對最優(yōu)的裂解條件進(jìn)行了相關(guān)的專業(yè)設(shè)計。 

對培養(yǎng)物進(jìn)行收獲和重懸之后，在RNase A存在的條件下使用NaOH-SDS（P2緩沖液）裂解細(xì)菌細(xì)胞。SDS溶解了細(xì)胞膜中的磷脂和蛋白成分，導(dǎo)致細(xì)胞裂解并釋放出內(nèi)容物。NaOH則對染色質(zhì)和質(zhì)粒DNA以及蛋白質(zhì)進(jìn)行變性。最優(yōu)化的裂解時間能夠讓細(xì)胞中釋放出最多的質(zhì)粒DNA，卻不會釋放出與細(xì)胞壁結(jié)合的染色體DNA，從而使得質(zhì)粒暴露于變性條件下的時間達(dá)到最小。堿性處理的時間過長可能導(dǎo)致質(zhì)粒DNA形成無法恢復(fù)的變性狀態(tài)。這一狀態(tài)的質(zhì)粒在瓊脂糖凝膠中移動得更快，并且能夠抵抗限制性內(nèi)切酶的降解。隨后通過加入酸性的醋酸鉀（P3緩沖液）對裂解液進(jìn)行中和。高的鹽分會導(dǎo)致KDS*發(fā)生沉淀，變性蛋白、染色體DNA和細(xì)胞碎片隨之被鹽——去垢劑復(fù)合物所俘獲。而質(zhì)粒DNA由于其更小的體積和共價閉合性，得以重新正確地復(fù)性并存留于液相之中。由于裂解液中任何殘存的SDS都會抑制DNA與QIAGEN樹脂的結(jié)合，所以裂解液必須緩慢而徹底地進(jìn)行混合，確保去垢劑完全沉淀。 

*十二烷基硫酸鉀。 

從染色體DNA中分離質(zhì)粒的原理主要基于細(xì)胞壁結(jié)合的染色體DNA與鹽分、去垢劑和蛋白的不溶復(fù)合物之間的共沉淀效應(yīng)。質(zhì)粒DNA則仍存留于上方澄清的液相當(dāng)中。裂解過程中的劇烈處理將會切斷細(xì)菌染色體，導(dǎo)致上清液中發(fā)生染色體DNA碎片的污染。后續(xù)的反應(yīng)條件將無法在化學(xué)上區(qū)分質(zhì)粒DNA與染色體碎片，因此這兩種成分將不會被QIAGEN樹脂分離，進(jìn)而在相同的鹽濃度下被一同洗脫下來。在實驗開始時加入的RNase A能夠有效降解堿裂解過程中釋放出的RNA成分。隨之產(chǎn)生的RNA片段在裂解液所處的鹽濃度和pH條件下不會與QIAGEN樹脂結(jié)合。沉淀物殘片通過離心，或QIAfilter Cartridge的使用得以去除，所生成的清亮裂解液可直接載入QIAGEN-tip中。這一階段中溶菌液的清澈對于保證液相的良好流動性十分重要，最終也將保障獲得完全去除蛋白質(zhì)的DNA產(chǎn)物。 

2、使用QIAfilter Cartridge澄清細(xì)菌裂解液 

QIAfilter Cartridge是一類特殊的過濾裝置，專為替代細(xì)菌堿裂解產(chǎn)物的離心步驟而設(shè)計。獲得培養(yǎng)物沉淀后，細(xì)菌細(xì)胞在NaOH-SDS中得以裂解，并添加酸性醋酸鉀參與中和，隨后直接進(jìn)入QIAfilter Cartridge中進(jìn)行孵育。裂解液只需數(shù)秒鐘便可通過過濾器，隨之獲得澄清的液相。在中和反應(yīng)中形成的，包含染色體DNA、鹽類、去垢劑和蛋白質(zhì)的不溶復(fù)合物在此過程中被完全出去。QIAfilter Cartridge對于細(xì)菌裂解產(chǎn)物的凈化作用相比傳統(tǒng)離心法更為有效。此外，通過離心無法凈化的小型SDS沉淀也可通過QIAfilter Cartridge完全除去。 

3、QIAGEN-tip中DNA的結(jié)合和洗滌 

清亮裂解液被載入預(yù)先平衡好的QIAGEN-tip當(dāng)中，通過重力流動完成結(jié)合反應(yīng)。裂解液的鹽分和pH條件與QIAGEN樹脂的優(yōu)異選擇性一起，確保了質(zhì)粒DNA結(jié)合的特異性，降解后的RNA、細(xì)胞蛋白和代謝物則不會發(fā)生結(jié)合而隨液相流出。進(jìn)一步使用中鹽緩沖液（QC緩沖液）洗滌QIAGEN-tip，以去除如痕量RNA和蛋白質(zhì)（例如RNase A）等任何形式的污染物殘留，該過程不會對質(zhì)粒DNA的結(jié)合造成任何影響。QC緩沖液同時也會打斷非特異性的相互作用，無需引入苯酚即可去除核酸結(jié)合蛋白。洗滌緩沖液中低濃度的酒精會消除非特異性的疏水性相互作用，從而提高所結(jié)合DNA的純度。自此之后，質(zhì)粒DNA被高鹽緩沖液（QF或QN緩沖液）從QIAGEN-tip上有效洗脫下來。 

4、通過離心實現(xiàn)脫鹽和濃縮 

洗脫的質(zhì)粒DNA通過異丙醇沉淀進(jìn)行脫鹽和濃縮。在室溫下進(jìn)行沉淀反應(yīng)以最大程度地減小鹽分的共沉淀效應(yīng)。在離心之后，使用70%乙醇對DNA沉淀進(jìn)行洗滌，以去除殘留的鹽分；同時以更易揮發(fā)的乙醇替代異丙醇，是為了方便在后續(xù)去除液相。純化后的DNA經(jīng)簡單的空氣干燥步驟和小體積pH8.0的TE緩沖液或pH8.5的Tris•Cl的重新溶解，即可用于轉(zhuǎn)染、測序、標(biāo)記、克隆，以及任何其他的實驗操作。 

5、使用QIAprecipitator Module進(jìn)行脫鹽和濃縮 

將洗脫得到的質(zhì)粒DNA與異丙醇進(jìn)行混合后，使用注射器將其加入試劑盒中的QIAprecipitator Module。該模塊能夠捕獲異丙醇液體混合物中的DNA沉淀。推薦使用乙醇進(jìn)行額外的洗滌步驟，最大程度地提升DNA的純度。QIAprecipitator得到的DNA沉淀形成了薄層結(jié)構(gòu)，通過使用注射器簡單推動，即可使空氣流經(jīng)QIAprecipitator，在去除酒精的同時實現(xiàn)了DNA的充分干燥。之后使用試劑盒提供的TE緩沖液將DNA從QIAprecipitator洗脫至一個微量離心管中。任何常用的緩沖液或水均可作為替代物進(jìn)行洗脫。如用純水洗脫，則DNA應(yīng)儲存于–20°C的溫度條件之下，因為DNA在缺乏緩沖系統(tǒng)及螯合劑的條件下會發(fā)生降解。這樣獲得的DNA產(chǎn)物適于進(jìn)行轉(zhuǎn)染、測序、標(biāo)記、克隆，以及其他任何的后續(xù)應(yīng)用。

以上信息來源于QIAGEN：