蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)效率提高方法及不同表達(dá)宿主的優(yōu)缺點(diǎn)
文章作者：red red sea 文章來(lái)源：Super Lab
背景介紹：在蛋白表達(dá)系統(tǒng)的相關(guān)研究中，從頭合成蛋白質(zhì)并不是一個(gè)可行的選擇。因此需要借助活細(xì)胞或細(xì)胞器用作生產(chǎn)和構(gòu)建蛋白質(zhì)的工廠。利用基因重組技術(shù)將特定基因的DNA序列作為模板生成蛋白質(zhì)，被稱(chēng)為重組蛋白。其原理是將目的基因通過(guò)電轉(zhuǎn)化或者熱激等手段轉(zhuǎn)入合適的宿主中，利用宿主的特定生理、生化和遺傳特點(diǎn)進(jìn)行目標(biāo)蛋白大量表達(dá)及純化的生物技術(shù)。廣泛應(yīng)用于結(jié)構(gòu)研究、生物治療、藥物開(kāi)發(fā)等。本篇推文將從蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建到如何提高蛋白的表達(dá)效率以及表達(dá)宿主如何選擇來(lái)進(jìn)行介紹，希望給做蛋白表達(dá)的初學(xué)者提供一些幫助！
蛋白質(zhì)的產(chǎn)生
蛋白質(zhì)合成的步驟，遺傳信息儲(chǔ)存于 DNA中，以此為模板經(jīng)轉(zhuǎn)錄生成信使 RNA，mRNA編碼的信息隨后被翻譯成氨基酸序列形成蛋白質(zhì)(圖1)。真核與原核生物轉(zhuǎn)錄和翻譯有一定區(qū)別。原核生物中轉(zhuǎn)錄和翻譯是同時(shí)發(fā)生的。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的信使RNA不需要剪切、拼接等，真核生物轉(zhuǎn)錄在細(xì)胞核中進(jìn)行，翻譯在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行，該過(guò)程是存在空間分隔的且有順序發(fā)生，翻譯后通過(guò)多種方式對(duì)多肽進(jìn)行修飾，形成蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。
圖1. 中心法則
蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建
通常來(lái)說(shuō)，典型的蛋白質(zhì)表達(dá)載體需包括以下主要元件：
• 多克隆位點(diǎn) (MCS) ；• 目的基因表達(dá)框：包括啟動(dòng)子和基因終止或 poly (A) 信號(hào) ；• 細(xì)菌的復(fù)制起始點(diǎn) (ori) ；• 宿主的抗生素篩選標(biāo)記：如嘌呤霉素(puromycin)、新霉素(neomycin)和殺稻瘟菌素（blasticidin) ；• 大腸桿菌的抗生素篩選標(biāo)記：如氨芐青霉素（Ampr）、氯霉素（Camr）、卡那霉素（Kanr等；• 表位標(biāo)簽等 。
表1. 重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)中常用的組成型和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子
| 宿主 | 組成型啟動(dòng)子 | 誘導(dǎo)型啟動(dòng)子 |
|---|---|---|
| 哺乳動(dòng)物 | CMV ；EF-1α；UbC；SV40 | 含Tet On的啟動(dòng)子；GAL4-USA |
| 大腸桿菌 | T7 | Lac |
| 昆蟲(chóng) | Ac5；p10； | MT |
| 酵母 | GAP | GAL1；AOX1 |
蛋白標(biāo)簽是重組蛋白制備過(guò)程中與目的蛋白融合表達(dá)的蛋白或多肽，標(biāo)簽蛋白的作用一般有：促進(jìn)目的蛋白的可溶性和穩(wěn)定性；便于目的蛋白被檢測(cè)；便于目的蛋白純化。隨著研究的需求和技術(shù)的發(fā)展，各種標(biāo)簽應(yīng)運(yùn)而生，多樣化的標(biāo)簽可以滿(mǎn)足不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?br />
表2. 常見(jiàn)的蛋白檢測(cè)標(biāo)簽
| 標(biāo)簽 | 應(yīng)用說(shuō)明 |
|---|---|
| His | 對(duì)目的蛋白的空間結(jié)構(gòu)影響極小，一般無(wú)需切除也不會(huì)對(duì)目標(biāo)蛋白功能產(chǎn)生太大影響。 |
| HA | 源于流感病毒的紅細(xì)胞凝集素表面抗原決定簇，對(duì)目標(biāo)蛋白的影響較小。 |
| c-Myc | 來(lái)源于人類(lèi)原癌基因Myc，由于可獲得高特異性Myc單克隆抗體，因此在Western blot，免疫熒光和免疫沉淀中被廣泛使用。但很少用于蛋白純化。 |
| Flag | 包含腸激酶的識(shí)別位點(diǎn)，方便去除，適合融合在目標(biāo)蛋白N端。親水性高，通常不會(huì)使與其連接的蛋白質(zhì)失活，常用于真核表達(dá)系統(tǒng)中目標(biāo)蛋白的檢測(cè)。 |
| 3×Flag | 可免疫原性和與抗體的親和性得到極大增強(qiáng)，適用于真核生物低水平表達(dá)的蛋白的檢測(cè)和純化。 |
| S | 通常將 S-tag 構(gòu)建到目標(biāo)蛋白的 N 末端或 C 末端上，可以使用商業(yè)化的 S-tag 抗體進(jìn)行免疫檢測(cè)。 |
| T7 | T7標(biāo)簽，一種源自T7噬菌體衣殼蛋白的表位標(biāo)簽，可購(gòu)買(mǎi)商業(yè)化的Anti－T7抗體檢測(cè)。T7標(biāo)簽常用于蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)。 |
| V5 | V5可融合到目標(biāo)蛋白C端，常用于哺乳動(dòng)物和昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)蛋白質(zhì)印跡，免疫熒光和免疫沉淀檢測(cè)。 |
表3. 蛋白純化標(biāo)簽及應(yīng)用
| 標(biāo)簽 | 應(yīng)用和純化方式 |
|---|---|
| His | 組氨酸殘基側(cè)鏈與固態(tài)的鎳有強(qiáng)烈的吸引力，可用于固定化金屬螯合層析(IMAC)，對(duì)重組蛋白進(jìn)行分離純化。 |
| GST | 該表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的GST標(biāo)簽蛋白可直接從細(xì)菌裂解液中利用含有還原型谷胱甘肽瓊脂糖凝膠親和樹(shù)脂進(jìn)行純化。 |
| MBP | MBP（麥芽糖結(jié)合蛋白），是大標(biāo)簽，分子量大小在40kDa以上，由大腸桿菌K12的malE基因編碼。MBP可增加目標(biāo)蛋白在細(xì)菌中的溶解性，尤其是真核蛋白，也可以增加融合蛋白表達(dá)量。融合蛋白可通過(guò)交聯(lián)淀粉親和層析一步純化。 |
| SUMO | 一種小分子泛素樣修飾蛋白，可作為融合標(biāo)簽，不但可以提高融合蛋白的表達(dá)量，且具有抗蛋白酶水解以及促進(jìn)目標(biāo)蛋白正確折疊，提高重組蛋白可溶性等功能。該標(biāo)簽主要用于改善目標(biāo)蛋白的表達(dá)，并非常用的純化標(biāo)簽，要用于純化可采用雙標(biāo)簽。 |
| CBD | CBD和一個(gè)來(lái)源于酵母的intein蛋白質(zhì)組成一個(gè)雙效的融合標(biāo)簽。融合表達(dá)產(chǎn)物在掛上親和層析柱后只需要在低溫（4℃）條件下用含DTT或者巰基乙醇，或者半胱氨酸的溶液洗脫，即可將目的蛋白洗脫，而將融合標(biāo)簽留在純化柱上，而還原劑的小分子可以非常簡(jiǎn)單的去除。 |
| Strep-tag II | Strep標(biāo)簽融合蛋白與鏈霉菌抗生物素蛋白柱上的基質(zhì)特異性結(jié)合，D-生物素或其衍生物可作為洗脫劑，從而實(shí)現(xiàn)融合蛋白的特異性純化。 |
提高蛋白表達(dá)的策略
密碼子優(yōu)化：選擇最合適的表達(dá)載體，構(gòu)建時(shí)進(jìn)行密碼子優(yōu)化，使蛋白質(zhì)在宿主內(nèi)表達(dá)更完全；提高蛋白溶解度：①調(diào)節(jié)表達(dá)條件參數(shù)：優(yōu)化培養(yǎng)基的濃度、pH值、類(lèi)型甚至是批次或批號(hào)，還可向培養(yǎng)基中添加特定的試劑，例如生長(zhǎng)因子和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)劑來(lái)提升蛋白表達(dá)水平；②融合蛋白標(biāo)簽：低產(chǎn)量提高蛋白表達(dá)的策略可使用分子融合伴侶技術(shù)。該策略利用啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、標(biāo)簽和其它融合元件來(lái)提高蛋白的溶解度。蛋白標(biāo)簽是插入到重組蛋白上的短肽序列，通常會(huì)在蛋白表達(dá)結(jié)束時(shí)采用酶切或化學(xué)試劑去除，比如His,Flag,GST；Fc等。③溫度：對(duì)于HEK293和其它哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，在37°C、5% CO2孵箱中培養(yǎng)細(xì)胞。有研究表明，在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)將溫度從37°C降至33°C培養(yǎng)，可提高HEK293細(xì)胞的蛋白表達(dá)。
如何選擇蛋白表達(dá)系統(tǒng)
目前，較為主流的表達(dá)宿主有大腸桿菌（E.coli）、畢赤酵母（P.pastoris）、昆蟲(chóng)-桿狀病毒（Bac-to-Bac系統(tǒng)）以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞系（CHO、HEK293）等。
| 蛋白表達(dá)系統(tǒng) | 優(yōu)點(diǎn) | 缺點(diǎn) |
|---|---|---|
| 細(xì)菌 | 1. 遺傳背景清楚；2. 繁殖快、成本低、抗污染能力強(qiáng)；3. 表達(dá)量高、表達(dá)產(chǎn)物分離純化相對(duì)簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好；4. 商品化的載體和菌株種類(lèi)非常齊全、適用范圍廣等。 | 1. 沒(méi)有真核轉(zhuǎn)錄后加工的功能，沒(méi)有翻譯后修飾；2. 表達(dá)的蛋白質(zhì)經(jīng)常是不溶的，容易形成包涵體；3. 有一些真核蛋白的產(chǎn)量和活性較低；4. 難以表達(dá)大分子哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)；5. 可能會(huì)產(chǎn)生一些致熱源(內(nèi)毒素) |
| 酵母 | 1. 結(jié)合了真核和原核的優(yōu)點(diǎn)，可生產(chǎn)翻譯后修飾的分泌蛋白和胞內(nèi)蛋白；2. 經(jīng)濟(jì)高效，部分真核翻譯后修飾，如糖基化，磷酸基化。 | 1. 可能形成不正確的蛋白糖基化；2. 培養(yǎng)上清多糖濃度高不利于純化 |
| 昆蟲(chóng) | 1. 表達(dá)水平高（特別是細(xì)胞內(nèi)蛋白），較快的生長(zhǎng)速度，有效的細(xì)胞折疊，中度可擴(kuò)展性；2. 廣泛的翻譯后修飾，糖基化與哺乳動(dòng)物細(xì)胞類(lèi)似，相對(duì)容易地酶促的去糖基化（對(duì)于蛋白結(jié)構(gòu)測(cè)定有利），3. 無(wú)內(nèi)毒素。4. 易于操作。桿狀病毒基因組較小，分子生物學(xué)特性簡(jiǎn)單；5. 昆蟲(chóng)細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)，容易放大培養(yǎng)；6. 可表達(dá)較大的外源性基因而不影響本身增殖； | 培養(yǎng)基昂貴（現(xiàn)已培養(yǎng)基成本有所下降，各種無(wú)血清培養(yǎng)基廣泛被應(yīng)用），需要大量的病毒，親肽的分泌通路低效，糖基化仍然不同于哺乳動(dòng)物細(xì)胞，病毒侵染會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞裂解和潛在的表達(dá)蛋白降解。 |
| 哺乳動(dòng)物穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng) | 1. 蛋白活性：翻譯后再加工修飾折疊的功能產(chǎn)生的外源蛋白質(zhì)，更接近于蛋白質(zhì)的天然狀態(tài)。2.正確的高級(jí)結(jié)構(gòu)（如糖基化）。3.在蛋白的起始信號(hào)、加工、分泌、糖基化方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，適合表達(dá)完整的大分子蛋白。 | 培養(yǎng)基成本高，培養(yǎng)周期長(zhǎng)，至少一個(gè)月以上，培養(yǎng)較困難，表達(dá)量較低。構(gòu)成復(fù)雜、操作技術(shù)要求高、表達(dá)產(chǎn)量不大、產(chǎn)率低 |
| 哺乳動(dòng)物瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng) | 1. 適度快速表達(dá)2. 很好表達(dá)膜蛋白和分泌蛋白3. 所有蛋白都能進(jìn)行折疊和最真實(shí)的翻譯后修飾 | 1. 比較貴2. 胞內(nèi)蛋白產(chǎn)量低 |
總之，各種表達(dá)系統(tǒng)各有優(yōu)缺點(diǎn)，使用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)成本相對(duì)較低，并且能夠在較短時(shí)間內(nèi)獲得表達(dá)產(chǎn)物，但目的蛋白常以包涵體形式表達(dá)，產(chǎn)物純化困難，且原核表達(dá)系統(tǒng)翻譯后加工修飾體系不完善，表達(dá)產(chǎn)物的生物活性較低。酵母和昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)蛋白表達(dá)水平高，成本低，但翻譯后加工修飾體系與哺乳動(dòng)物不完全相同。哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)更接近于天然狀態(tài)，但表達(dá)量低，操作繁瑣。因此，選擇表達(dá)系統(tǒng)時(shí)，應(yīng)充分考慮各種因素，如要表達(dá)蛋白的性質(zhì)、生產(chǎn)成本、表達(dá)水平、安全性、表達(dá)周期等。
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