藥物早期研發(fā)的基本流程和準(zhǔn)則

原創(chuàng)： TSS轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)譜 文章來源：TSS轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)譜

開發(fā)新藥是一個(gè)復(fù)雜的過程，可能需要 12 至 15 年的時(shí)間，成本超 10 億美元。藥物發(fā)現(xiàn)過程的臨床前階段，從最初的靶標(biāo)識(shí)別和驗(yàn)證，到分析方法開發(fā)、高通量篩選、命中識(shí)別、先導(dǎo)優(yōu)化等，最后選擇用于臨床開發(fā)的候選分子。



藥物研發(fā)概況
藥物研發(fā)的驅(qū)動(dòng)因素是存在未滿足的臨床需求。最初通常發(fā)生在學(xué)術(shù)界，并提出一個(gè)治療假設(shè)，即蛋白質(zhì)或通路的抑制或激活將在疾病狀態(tài)下產(chǎn)生治療效果。由此，確定一個(gè)靶標(biāo)，在進(jìn)入先導(dǎo)藥物發(fā)現(xiàn)階段之前可能需要進(jìn)一步驗(yàn)證，以證明藥物發(fā)現(xiàn)工作的合理性（圖 1）。在先導(dǎo)藥物發(fā)現(xiàn)過程中，隨后會(huì)進(jìn)行深入的研究，以找到類藥性的小分子或生物治療劑（通常稱為候選藥物，Candidate）；該藥物將進(jìn)入臨床前階段；如果成功，則進(jìn)入臨床開發(fā)階段（圖 2 ）；并最終成為上市藥物。

圖1. 從靶標(biāo)識(shí)別、驗(yàn)證到候選藥物發(fā)現(xiàn)過程及預(yù)期時(shí)間。

圖2. 藥物發(fā)現(xiàn)篩選分析概述。

靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)
藥物在臨床上失敗的主要原因有兩個(gè)：第一是它們不起作用，第二是它們不安全。因此，開發(fā)新藥最重要的步驟之一是靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證。靶標(biāo)是一個(gè)廣泛的術(shù)語，可以是一系列生物實(shí)體，例如蛋白質(zhì)、基因和RNA。一個(gè)好的靶點(diǎn)需要有效、安全、滿足臨床和商業(yè)化需求，最重要的是“可成藥”。“可成藥”靶點(diǎn)可接近推定的藥物分子，無論是小分子還是較大的生物制品，并且在結(jié)合后引發(fā)可在體外和體內(nèi)可測(cè)量的生物反應(yīng)。

如今可用生物醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)挖掘?qū)е掳袠?biāo)的顯著增加。在這種情況下，數(shù)據(jù)挖掘是指使用生物信息學(xué)方法，不僅幫助識(shí)別，而且?guī)椭�選擇和優(yōu)先考慮潛在的疾病靶標(biāo)�？捎脭�(shù)據(jù)，包括出版物和專利信息、基因表達(dá)數(shù)據(jù)、蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)、轉(zhuǎn)基因表型和化合物分析數(shù)據(jù)。涉及方法，包括檢查 mRNA/蛋白質(zhì)水平，以確定它們是否在疾病中表達(dá)以及它們是否與疾病惡化或進(jìn)展相關(guān)。另一種有效的方法是尋找遺傳關(guān)聯(lián)，例如，遺傳多態(tài)性與疾病或疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)之間是否存在聯(lián)系，或者多態(tài)性是否具有功能。最后，還可以使用表型篩選來識(shí)別疾病相關(guān)靶標(biāo)。

靶標(biāo)驗(yàn)證
一旦確定靶標(biāo)，靶標(biāo)就需要受到全面驗(yàn)證。驗(yàn)證技術(shù)的范圍從體外工具到動(dòng)物模型，再到在疾病患者中調(diào)節(jié)所需靶標(biāo)。雖然每種方法本身都是有效的，但多重驗(yàn)證方法顯著提高了結(jié)果的置信度（圖 3 ）。

圖3. 靶標(biāo)識(shí)別和驗(yàn)證是多功能的研究過程。

靶標(biāo)驗(yàn)證常見的技術(shù)包括基因敲除、基因敲減、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型、單克隆抗體、和化學(xué)基因組等多種方法。

命中分子(Hit)發(fā)現(xiàn)
在靶標(biāo)驗(yàn)證過程之后，在藥物發(fā)現(xiàn)過程的命中識(shí)別和先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)階段，開發(fā)了化合物篩選測(cè)定方法。“命中化合物”即是在化合物篩選中具有所需活性且其活性在重新測(cè)試后得到確認(rèn)的化合物。存在多種篩選范例來鑒定命中分子。

高通量篩選(High throughput)，通常在 384 孔及以上的板中測(cè)定分析大量化合物。大型化合物庫通常由大型制藥公司運(yùn)營(yíng)，但較小的化合物庫也可以在制藥公司或?qū)W術(shù)界運(yùn)營(yíng)，這有助于降低成本。商業(yè)公司現(xiàn)在還嘗試使用計(jì)算機(jī)輔助分析來覆蓋更廣泛的化學(xué)空間，以減少篩選的化合物數(shù)量。

特定文庫篩選，先前鑒定為擊中特定類別靶標(biāo)（例如激酶）的化合物、以及具有相似結(jié)構(gòu)的化合物。提供更便宜的途徑來尋找命中分子，但可能無法發(fā)現(xiàn)全新的結(jié)構(gòu)，并且可能難以獲得專利授權(quán)。

片段篩選，將小化合物浸泡到晶體中以獲得低(mM) 活性的化合物，然后將其用作較大分子的構(gòu)建模塊。

結(jié)構(gòu)輔助藥物設(shè)計(jì)，使用晶體結(jié)構(gòu)輔助設(shè)計(jì)分子。在這種情況下，通常會(huì)將化合物對(duì)接到晶體中，并使用它來輔助預(yù)測(cè)可以在何處添加修飾以提供增強(qiáng)的效力或選擇性。

虛擬篩選，使用對(duì)接模型：用蛋白質(zhì)的 X 射線結(jié)構(gòu)篩選虛擬化合物庫，或者基于已知的配體的藥效團(tuán)篩選，作為開發(fā)進(jìn)一步化合物的基礎(chǔ)。還可以特定文庫篩選提供起始結(jié)構(gòu)，而無需使用昂貴的大型庫文庫篩選。

生理活性篩選，一種基于組織的方法，用于確定藥物在組織而不是細(xì)胞或亞細(xì)胞水平上的作用，例如肌肉收縮力。通量較低的定制篩選。旨在更接近地模擬體內(nèi)的復(fù)雜性，而不是僅僅查看單個(gè)讀數(shù)。
親和力篩選（包括 DEL庫，質(zhì)譜/核磁共振等篩選），通過與已知蛋白質(zhì)靶標(biāo)結(jié)合來篩選較小化合物（片段），以尋找具有與靶標(biāo)結(jié)合活性的化合物。

檢測(cè)方法開發(fā)
一般來說，細(xì)胞測(cè)定應(yīng)用于多種類別的靶標(biāo)，例如膜受體、離子通道和核受體，并且可根據(jù)化合物活性生成活性讀數(shù)。相比之下，生化測(cè)定則主要應(yīng)用于受體和酶類靶標(biāo)。也可簡(jiǎn)單地測(cè)量測(cè)試化合物對(duì)靶蛋白的親和力。生化和基于細(xì)胞的測(cè)定的檢測(cè)范例均已成功用于識(shí)別命中分子和候選分子。

測(cè)定形式的選擇取決于藥物靶蛋白的生物學(xué)機(jī)制、基本的設(shè)備儀器基礎(chǔ)設(shè)施、科學(xué)家的經(jīng)驗(yàn)、是尋找抑制劑或激活劑、及篩選規(guī)模等。例如，GPCR 篩選可測(cè)定配體與受體的親和力，可測(cè)量 G 蛋白的鳥嘌呤核苷酸交換；還可以測(cè)量化合物介導(dǎo)的信號(hào)的變化：許多第二信使，包括鈣、cAMP 或磷酸肌醇，或下游報(bào)告基因的激活。無論選擇哪種檢測(cè)形式，都需要考慮以下因素：

測(cè)定的藥理學(xué)相關(guān)性。如果可行，應(yīng)使用對(duì)所研究的靶點(diǎn)具有活性的已知配體進(jìn)行研究，以確定測(cè)定藥理學(xué)是否可以預(yù)測(cè)疾病狀態(tài)，并表明該測(cè)定能夠識(shí)別所需效力和作用機(jī)制的化合物。

測(cè)定的重現(xiàn)性。在化合物篩選環(huán)境中，要求該測(cè)定在各個(gè)測(cè)定板、各個(gè)篩選日期以及可能運(yùn)行數(shù)年的程序內(nèi)、在整個(gè)藥物研發(fā)的持續(xù)時(shí)間內(nèi)可重復(fù)。

測(cè)定費(fèi)用。化合物篩選測(cè)定通常在微孔板中進(jìn)行。在學(xué)術(shù)界或相對(duì)少量的化合物測(cè)定通常在 96 孔或 384 孔微量滴定板中進(jìn)行，而在工業(yè)或 HTS 應(yīng)用中，測(cè)定在 384 孔或 1536 微孔板中進(jìn)行格式化，測(cè)定體積小至幾微升。在每種情況下，選擇測(cè)定試劑和測(cè)定體積以最小化測(cè)定成本。

測(cè)定質(zhì)量。測(cè)定質(zhì)量通常根據(jù) Z' 因子確定。這是一個(gè)統(tǒng)計(jì)參數(shù)，除了考慮測(cè)定中的信號(hào)窗口之外，還考慮測(cè)定中高信號(hào)和低信號(hào)周圍的方差。Z 因子已成為測(cè)量板基上測(cè)定質(zhì)量的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法。Z因子的范圍是0到1；Z 因子大于 0.4 的測(cè)定被認(rèn)為對(duì)于化合物篩選來說是適當(dāng)穩(wěn)健的，盡管許多研究組更喜歡使用 Z 因子大于 0.6 的測(cè)定。除了 Z 因子測(cè)定質(zhì)量外，還通過在每次測(cè)定中納入藥理學(xué)對(duì)照來監(jiān)測(cè)質(zhì)量。如果標(biāo)準(zhǔn)化合物的藥理學(xué)落在預(yù)定限度內(nèi)，則認(rèn)為測(cè)定是可接受的。檢測(cè)質(zhì)量受多種因素影響。一般來說，高質(zhì)量的檢測(cè)是通過執(zhí)行簡(jiǎn)單的檢測(cè)方案（步驟少）、最大限度地減少檢測(cè)中的清洗步驟或板與板之間的試劑轉(zhuǎn)移、使用穩(wěn)定的試劑和生物制品以及確保用于執(zhí)行檢測(cè)的所有儀器來創(chuàng)建的。通常通過實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化控制來實(shí)現(xiàn)。

化合物在測(cè)定中的作用�；瘜W(xué)庫通常儲(chǔ)存在有機(jī)溶劑中，例如乙醇或二甲基亞砜 (DMSO)。因此，需要開發(fā)對(duì)測(cè)定中所用溶劑的濃度不敏感的測(cè)定。通常，基于細(xì)胞的測(cè)定不能耐受高于 1% DMSO ，而生化測(cè)定可以在高達(dá) 10% DMSO 的溶劑濃度中進(jìn)行。還應(yīng)確定檢測(cè)中的假陰性和假陽性命中率。最后，應(yīng)考慮化合物篩選濃度。用于發(fā)現(xiàn)命中的化合物篩選測(cè)定通常在 1–10 µM 化合物濃度下運(yùn)行。在這些濃度下，可以鑒定活性高達(dá) 40 µM 的化合物，可以改變測(cè)試濃度來鑒定具有更高或更低活性的化合物。
在開發(fā) HTS 測(cè)定時(shí)（可能需要在幾周內(nèi)篩選數(shù)百萬個(gè)分子），最佳方案是首先篩選化合物的訓(xùn)練集，以驗(yàn)證測(cè)定的性能是否可接受。圖4 顯示了在1536孔HTS測(cè)定中針對(duì)中國倉鼠卵巢細(xì)胞中表達(dá)的組胺H1受體的12000個(gè)化合物的篩選。通過重復(fù)兩次或三次，以識(shí)別測(cè)定中的命中率、測(cè)定的再現(xiàn)性以及測(cè)定中的假陽性和假陰性命中率。目前，已經(jīng)開發(fā)了統(tǒng)計(jì)包來識(shí)別這些參數(shù)。

當(dāng)進(jìn)行篩選以檢測(cè)激動(dòng)劑配體時(shí)，水母發(fā)光蛋白(Aequorin，能夠結(jié)合游離的鈣離子)測(cè)定的命中率通常小于篩選化合物的 0.5%，而統(tǒng)計(jì)測(cè)定截止值為標(biāo)準(zhǔn)激動(dòng)劑配體所見的激動(dòng)劑信號(hào)的 5% 或更低。在這種檢測(cè)形式中，假陽性和假陰性的命中率非常低。

對(duì)于拮抗劑篩選，水母發(fā)光蛋白測(cè)定中的命中率通常為以大于 25% 抑制的活性截止，占篩選的化合物的 2-3%。這是所有篩選測(cè)定的常見現(xiàn)象。拮抗劑或抑制劑形式的命中率往往高于激動(dòng)劑測(cè)定中的命中率，因?yàn)檗卓箘�測(cè)定（通過檢測(cè)測(cè)定信號(hào)的減少來定義）還將檢測(cè)干擾信號(hào)系統(tǒng)產(chǎn)生的化合物。完成穩(wěn)健性測(cè)試后，檢測(cè)將進(jìn)入 HTS。在 HTS 期間，每天要篩選多達(dá) 200 個(gè)檢測(cè)板，通常使用復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化技術(shù)。在篩選過程中，根據(jù)測(cè)定板上的 Z' 和標(biāo)準(zhǔn)化合物的藥理學(xué)差異來測(cè)定性能，如果這些質(zhì)量控制措施超出預(yù)定限度，則測(cè)定板失敗并重新篩選（圖 5）。

圖4. 水母發(fā)光蛋白高通量篩選：驗(yàn)證測(cè)試 GPCR 拮抗劑測(cè)定（1536 孔）。將表達(dá)組胺 H1 受體和鈣敏感發(fā)光蛋白水母發(fā)光蛋白的細(xì)胞分配到 1536 孔微量滴定板中。一式兩份篩選總共 12,000 種化合物，以檢測(cè)激動(dòng)劑配體（左圖）和拮抗劑配體（右圖）。在激動(dòng)劑測(cè)定（左圖）中，沒有藥物反應(yīng)以紅色表示，對(duì)配體組胺最大濃度的反應(yīng)以藍(lán)色表示，化合物數(shù)據(jù)以黃色表示。正如激動(dòng)劑測(cè)定中常見的那樣，由于不存在假陽性，命中率非常低。在拮抗劑測(cè)定中（右圖），在不存在測(cè)試化合物的情況下對(duì)組胺的反應(yīng)以紅色表示（基礎(chǔ)反應(yīng)），對(duì)組胺拮抗劑最大濃度的反應(yīng)以藍(lán)色表示（100%抑制），化合物數(shù)據(jù)以黃色表示。正如在基于細(xì)胞的抑制劑測(cè)定中常見的那樣，由于測(cè)定干擾和化合物活性的結(jié)合，化合物數(shù)據(jù)存在顯著的分散分布。真正的活性在 40% 至 100% 抑制范圍內(nèi)相關(guān)。兩種檢測(cè)均具有出色的 Z'。

圖5. 高通量篩選中的質(zhì)量控制 (QC)。為了確�；�合物篩選活動(dòng)中篩選數(shù)據(jù)的控制，每個(gè)測(cè)定板通常包含許多藥理學(xué)對(duì)照化合物。(A)每個(gè)384孔板包含16個(gè)含有低對(duì)照的孔和另外16個(gè)含有EC100濃度的藥理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品的孔，其用于計(jì)算Z'因子。Z' 系數(shù)低于 0.4 的板將被重新篩選。(B) 每個(gè)板還包含 16 個(gè) EC 50濃度的藥理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品孔，以監(jiān)測(cè)測(cè)定中的差異（菱形）。(C) 為所有通過藥理學(xué)標(biāo)準(zhǔn) QC 的板布局生成熱圖，以監(jiān)測(cè)整個(gè)測(cè)定板的活性分布。在整個(gè)篩選板上看到活動(dòng)的應(yīng)隨機(jī)分布。由于活性孔聚集在板的中心，因此所提供的板將失敗并重新篩選。

確定命中系列化合物
一般化合物庫的分子遵循Lipinski五法則，分子量小于400、和clogP小于 4（親脂性的量度，影響體內(nèi)吸收），具有這些特征的分子被稱為“類藥物”，這是因?yàn)榇蠖鄶?shù)臨床上市藥物的分子量小于 350，cLogP 小于 3。以簡(jiǎn)單的小分子作為先導(dǎo)物優(yōu)化來啟動(dòng)藥物發(fā)現(xiàn)計(jì)劃至關(guān)重要，以提高效力和選擇性，通常涉及增加分子量，這反過來又會(huì)導(dǎo)致安全性和耐受性問題。

一旦通過虛擬篩選或 HTS 獲得了一些命中結(jié)果，藥物發(fā)現(xiàn)團(tuán)隊(duì)的首要任務(wù)就是嘗試確定哪些化合物最適合研究。這種分類過程至關(guān)重要，因?yàn)樵谝粋�(gè)大型庫中，團(tuán)隊(duì)可能會(huì)留下許多可能的命中，他們需要減少、確認(rèn)這些命中并將其聚類為系列化合物。實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)需要采取幾個(gè)步驟。首先，盡管隨著化合物庫質(zhì)量的提高，這不再是一個(gè)問題，但文庫監(jiān)管員已知在 HTS 中頻繁出現(xiàn)的化合物需要從進(jìn)一步考慮從中刪除。其次，已經(jīng)開發(fā)了許多計(jì)算化學(xué)算法，根據(jù)結(jié)構(gòu)相似性對(duì)命中進(jìn)行分組，以確保在提出的化合物列表中代表廣泛的化學(xué)類別。使用這些算法對(duì)化合物命中列表進(jìn)行分析，可以根據(jù)化學(xué)簇、效力和配體效率等因素來選擇命中，從而了解化合物與其分子大小的結(jié)合效率（對(duì)數(shù)效力除以“重要原子數(shù)”，即分子中的非氫原子）。

下一步，則是對(duì)每個(gè)命中進(jìn)行主要測(cè)定，并生成劑量反應(yīng)曲線。命中分子表現(xiàn)出正常的動(dòng)力學(xué)行為很重要。表現(xiàn)出全有或全無響應(yīng)的化合物不是以可逆的方式起作用，實(shí)際上也可能根本不與靶蛋白結(jié)合，高濃度下的活性是由樣品和測(cè)定系統(tǒng)的另一組分之間的相互作用產(chǎn)生的�？赡婊�合物受到青睞，因?yàn)樗鼈兊乃幚碜饔迷谕Ｋ幒蟾�容�?ldquo;消失”，這是在患者中使用時(shí)的一個(gè)重要考慮因素。獲得劑量反應(yīng)曲線可以生成半數(shù)最大抑制濃度(IC50)，用于比較候選化合物的效力。

新鮮的化合物樣品是非常必要的。但幾乎所有 HTS 文庫都以冷凍 DMSO 溶液的形式保存，因此一段時(shí)間后，化合物可能會(huì)降解或變性。事實(shí)上，當(dāng)重新合成該化合物并用于重新測(cè)試時(shí)，有效的活性可能消失，盡管偶爾鑒定出有效的雜質(zhì)可以取得進(jìn)展。

通過在對(duì)目標(biāo)的主要測(cè)定中生成可靠的劑量反應(yīng)曲線，該階段是在二級(jí)測(cè)定中檢查幸存的命中（如果可用），以選擇最終命中。這不需要是高通量形式的測(cè)定，而是觀察化合物在功能反應(yīng)中的影響，例如在第二信使測(cè)定中或在基于組織或細(xì)胞的生物測(cè)定中。在這種情況下的活性將確�；�合物能夠調(diào)節(jié)更完整的系統(tǒng)，而不是簡(jiǎn)單地與主要測(cè)定中使用的分離的且經(jīng)常工程化的蛋白質(zhì)相互作用。

在整個(gè)確認(rèn)過程中，藥物化學(xué)家將尋求將化合物分組，以構(gòu)成先導(dǎo)系列的基礎(chǔ)。作為該過程的一部分，將考慮每個(gè)簇的屬性，例如是否存在在許多化合物上演變的可識(shí)別的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系（SAR），即識(shí)別具有某些部分的一組化合物或共同的化學(xué)基團(tuán)，并且向該核心結(jié)構(gòu)添加不同的化學(xué)基團(tuán)會(huì)產(chǎn)生不同的效力。還將研究化學(xué)合成問題。因此，將評(píng)估制備的簡(jiǎn)易性、平行合成的潛在適應(yīng)性、以及從后期中間體產(chǎn)生多樣性的能力。

確定命中系列后，現(xiàn)在可以對(duì)多組化合物并行進(jìn)行研究。這一步將包括快速生成基本的SAR 數(shù)據(jù)、并定義與活性相關(guān)的結(jié)構(gòu)中的基本要素。同時(shí)，每個(gè)系列的代表性實(shí)例將接受各種體外測(cè)定，旨在提供有關(guān)吸收、分布、代謝和排泄 (ADME) 特性，以及理化和藥代動(dòng)力學(xué) (PK) 的數(shù)據(jù)（見表１）。此時(shí)可能需要進(jìn)行選擇性分析，特別是針對(duì)最初制備化合物的目標(biāo)類型（如果有），也很有用。例如，您可能想要抑制激酶 X，但避免激酶 Y，以減少不需要的體內(nèi)副作用。此階段進(jìn)行的系列數(shù)量將取決于可用資源，但理想情況下，考慮到可能的失敗，應(yīng)將多個(gè)系列納入“從命中到先導(dǎo)”階段，以便順利進(jìn)入下一階段。通常得到的命中分子對(duì)藥物靶標(biāo)的效力為 100 nM–5 µM，將啟動(dòng)藥物化學(xué)項(xiàng)目以進(jìn)一步提高該分子的效力。

表１. 早期藥物發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵體外測(cè)定的參考標(biāo)準(zhǔn)


命中到先導(dǎo)分子
此階段工作的目的是完善每個(gè)命中系列測(cè)試分析，以嘗試生產(chǎn)更有效和更具選擇性的化合物，并具有一定的體內(nèi)模型中 PD/PK 特性。

將圍繞每個(gè)核心化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入的 SAR 研究，并進(jìn)行測(cè)量以確定每個(gè)化合物的活性和選擇性。這需要系統(tǒng)地進(jìn)行，并且在已知靶標(biāo)結(jié)構(gòu)信息的情況下，可以應(yīng)用使用分子建模和 X 射線晶體學(xué)和 NMR 等方法的基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)技術(shù)，以更快、更有針對(duì)性地 SAR 分析。通常還會(huì)確定目標(biāo)蛋白上的結(jié)合位點(diǎn)。

此時(shí)的篩選包括相對(duì)高通量的測(cè)定，確定每個(gè)分子對(duì)靶標(biāo)的活性及選擇性，對(duì)已知或預(yù)計(jì)存在的問題進(jìn)行測(cè)定（圖6 )。

圖6. 假定的藥物篩選流程。從高通量篩選 (HTS) 到候選分子確定的測(cè)定示例。

此外，必須進(jìn)行更詳細(xì)的理化和體外ADME 特性分析，這些研究是并行進(jìn)行的，選擇關(guān)鍵化合物進(jìn)行評(píng)估。表 1 顯示了要考慮的檢測(cè)類型以及合適的目標(biāo)。

溶解度和滲透性評(píng)估對(duì)于判斷或排除化合物作為藥物的潛力至關(guān)重要，缺乏這兩種特性的化合物無論在初級(jí)篩選試驗(yàn)中多么有效，都不太可能成為藥物。微粒體穩(wěn)定性是體內(nèi)代謝酶修飾然后清除化合物的能力的有用量度，也可以使用肝細(xì)胞。對(duì) CYP450 抑制進(jìn)行檢查是新化合物是否可能影響與其共同給藥的現(xiàn)有藥物的代謝的重要預(yù)測(cè)因素。如果這些特性中的一種或多種不理想，那么可能需要專門針對(duì)這些特性篩選更多的化合物。

達(dá)到目標(biāo)效力和選擇性的關(guān)鍵化合物，以及大多數(shù)理化和 ADME 目標(biāo)，應(yīng)在大鼠中進(jìn)行 PK 評(píng)估。在這里，當(dāng)化合物靜脈給藥時(shí)，通常的目標(biāo)是半衰期為 >60 分鐘，口服給藥后吸收超過 20%，盡管有時(shí)不同的目標(biāo)需要非常不同的 PK 曲線。此外，需要考慮潛在毒性，hERG 通道是一種鉀電壓門控離子通道，對(duì)心臟功能和抑制很重要，可導(dǎo)致心臟負(fù)擔(dān)。對(duì)于 hERG，我們的理想目標(biāo)是活性超過 30 uM 或至少 1000 倍的靶標(biāo)選擇性。

許多滿足所述要求的這些化合物在 PK 研究中，發(fā)現(xiàn)靜脈給藥后具有合理的半衰期，但當(dāng)給大鼠口服該化合物時(shí)，發(fā)現(xiàn)血漿水平較差。研發(fā)項(xiàng)目從命中到先導(dǎo)階段的一些化合物雖然本身不太可能取得進(jìn)展，但能夠回答疾病模型中的問題。因此，化合物可被腹腔內(nèi)給藥，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也為開發(fā)方案提供了實(shí)質(zhì)性的證據(jù)。

先導(dǎo)化合物優(yōu)化階段

最后，藥物發(fā)現(xiàn)階段的目標(biāo)是保持先導(dǎo)化合物的有利特性，同時(shí)改善先導(dǎo)結(jié)構(gòu)的缺陷。此階段的化合物可被視為已滿足先導(dǎo)化合物優(yōu)化階段的初始目標(biāo)，并已準(zhǔn)備好作為臨床前候選藥物之前進(jìn)行最終表征。

一般來說，分子還需要在遺傳毒性模型（例如Ames test）和一般行為的體內(nèi)模型（例如Irwin's test）中進(jìn)行檢查。高劑量藥理學(xué)、PK/PD 研究、劑量線性 PK、重復(fù)給藥 PK、 尋找藥物誘導(dǎo)的代謝和代謝譜都需要在此階段結(jié)束時(shí)進(jìn)行。還需要考慮化學(xué)穩(wěn)定性問題和推定原料藥的選擇。

在此階段收集到的有關(guān)該分子的所有信息將有助于準(zhǔn)備目標(biāo)候選分子資料，與毒理學(xué)、化學(xué)制造、以及控制考慮因素一起，將構(gòu)成監(jiān)管提交的基礎(chǔ)，以允許開始人體給藥。

行業(yè)內(nèi)只有 10% 的小分子項(xiàng)目可能會(huì)過渡到候選分子階段，在此前多個(gè)階段都可能失敗。這些可能包括: (i) 無法進(jìn)行可靠的檢測(cè)；(ii) 沒有從 HTS 獲得可開發(fā)的命中分子；(iii) 化合物在二級(jí)或天然組織測(cè)定中表現(xiàn)不符合預(yù)期；(iv) 化合物在體外或體內(nèi)有毒；(v) 化合物具有不良副作用；(vi) 無法獲得符合人體所需給藥方案的良好 PK 或 PD 曲線，例如，如果需要每天一次片劑，則需要該化合物具有適合實(shí)現(xiàn)此目的的體內(nèi)半衰期；(vii) 目標(biāo)位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的化合物無法穿過血腦屏障。

此外，盡管與藥物開發(fā)和臨床階段后期進(jìn)行的許多流程相比，成本相對(duì)較低，但臨床前活動(dòng)的風(fēng)險(xiǎn)足夠高，且距財(cái)務(wù)回報(bào)遙遠(yuǎn)，常常使其成為一個(gè)問題。一旦選擇了候選藥物，進(jìn)入臨床階段的化合物的流失率也很高，同樣只有10％的候選藥物進(jìn)入市場(chǎng)，但在這個(gè)階段失敗的財(cái)務(wù)損失后果要高得多。關(guān)于如何通過“快速而廉價(jià)地失敗”來提高成功率，業(yè)界存在相當(dāng)多的爭(zhēng)論。

一旦候選分子達(dá)到臨床階段，終止該項(xiàng)目就會(huì)變得越來越困難，因?yàn)樵谶@個(gè)階段該項(xiàng)目已經(jīng)成為公眾所知，因此終止會(huì)影響對(duì)公司和股東價(jià)值的信心。在臨床開發(fā)之前進(jìn)行更多研究，例如改進(jìn)毒理學(xué)篩選（使用失敗的藥物為這些測(cè)定提供信息）、基于全面的疾病理解建立預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)化模型并識(shí)別生物標(biāo)志物可能有助于這一努力。尤其是在后兩個(gè)領(lǐng)域，學(xué)術(shù)界與產(chǎn)業(yè)界的合作可以真正增加臨床前的價(jià)值，并最終幫助為患者帶來更有效的藥物。