全基因組擴(kuò)增技術(shù)介紹

研究人員通常會在下游分析中遭遇DNA樣本量有限或不足的問題。QIAGEN的全基因組擴(kuò)增技術(shù)通過以包括單細(xì)胞在內(nèi)的小量樣本或珍貴樣本擴(kuò)增獲得基因組DNA，解決此類難題。REPLI-g Kit能夠準(zhǔn)確地復(fù)制原始DNA樣本，不會造成偏差，擴(kuò)增后的DNA可以直接應(yīng)用于廣泛的遺傳學(xué)分析。

什么是全基因組擴(kuò)增(whole gemome amplification)？
做為一種增加有限D(zhuǎn)NA量的方法，全基因組擴(kuò)增技術(shù)于1992年出現(xiàn)，該方法特別適于法醫(yī)學(xué)鑒定和遺傳疾病的研究，以及如二代測序技術(shù)和CGH陣列（比較基因組雜交）等新技術(shù)應(yīng)用，后者的主要難題就在于DNA樣本數(shù)量有限，但分析需求量又很可觀。目前業(yè)界已經(jīng)開發(fā)出多種WGA技術(shù)，它們之間的實(shí)驗(yàn)方案和復(fù)制準(zhǔn)確度有所不同。

WGA技術(shù)——PCR技術(shù)與多重置換擴(kuò)增（MDA）技術(shù)的比較 
業(yè)界已經(jīng)開發(fā)出多種WGA技術(shù)；不過這些技術(shù)在其擴(kuò)增準(zhǔn)確性和易用性等方面有所區(qū)別。QIAGEN的REPLI-g Kit采用被稱為多重置換擴(kuò)增的WGA技術(shù)，能夠提供無偏差的準(zhǔn)確全基因組擴(kuò)增。 

基于PCR的WGA技術(shù)

基于PCR的WGA技術(shù)主要有兩種：簡并寡核苷酸PCR (DOP-PCR)技術(shù)(1)和擴(kuò)增前引物延伸(PEP)技術(shù)(2)。這兩種技術(shù)之間的主要區(qū)別在于PEP技術(shù)使用隨機(jī)引物和低PCR退火溫度，而DOP-PCR技術(shù)則使用半簡并寡核苷酸（例如CGACTCGAGNNNNNNATGTGG）和更高的退火溫度。兩種方法中都使用了Taq DNA聚合酶，使得擴(kuò)增長度限制在3 kb（平均片段長度為400–500 kb）以內(nèi)，并且會在擴(kuò)增序列中引入一些錯(cuò)誤。不僅如此，有研究發(fā)現(xiàn)這些技術(shù)的基因組覆蓋度不夠完整，并會在擴(kuò)增中產(chǎn)生偏向性——由于引物優(yōu)先結(jié)合某些特定區(qū)域，造成DNA擴(kuò)增產(chǎn)物中的一些序列相對增多。

多重置換擴(kuò)增的WGA技術(shù)

REPLI-g使用了稱為多重置換擴(kuò)增(MDA)的恒溫基因組擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)包含了隨機(jī)六聚體與變性DNA的結(jié)合過程，以及使用Phi 29聚合酶在恒定溫度下進(jìn)行的鏈置換合成過程。每個(gè)置換鏈上添加引物后，形成分枝狀的DNA結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)。Phi 29聚合酶不會從基因組DNA模板上面解離下來，這使得生成的無偏差DNA片段可延伸至100 kb。該酶還具有3’端→5’端的外切酶校正活性，相比基于Taq DNA聚合酶的方法，能夠提供高達(dá)1000倍的保真度（參見上述基于PCR的WGA技術(shù)）。Phi 29聚合酶由獨(dú)特的REPLI-g優(yōu)化緩沖液進(jìn)行支撐，能夠方便的克服如發(fā)卡環(huán)一類的二級結(jié)構(gòu)困難，在擴(kuò)增過程中避免滑脫、定制和聚合酶解離等現(xiàn)象的發(fā)生。這樣無偏差的DNA片段能夠合成至100 kb的長度。 

MDA技術(shù)與基于PCR的WGA方法相比的優(yōu)勢

傳統(tǒng)的基因組DNA擴(kuò)增方法包括費(fèi)時(shí)的EBV轉(zhuǎn)化細(xì)胞系建立過程，以及之后使用隨機(jī)或簡并寡核苷酸引物進(jìn)行的PCR全基因組擴(kuò)增步驟。為其他廠商所普遍采用的基于PCR的WGA法，也會產(chǎn)生非特異性的擴(kuò)增干擾以及不完全的位點(diǎn)覆蓋度。某些案例中可能生成短于1 kb長度的DNA片段，在很多后續(xù)應(yīng)用中無法使用。通常情況下，由于使用了低保真度的Taq DNA聚合酶，使生成的DNA中包含了很高的堿基突變率，因此形成了容易出錯(cuò)的擴(kuò)增，導(dǎo)致如單堿基對突變、STR縮短和擴(kuò)張等不良后果的發(fā)生。REPLI-g則沒有這些缺點(diǎn)，它能對整個(gè)基因組進(jìn)行高度均一的擴(kuò)增，反應(yīng)過程中位點(diǎn)序列的偏差及突變率達(dá)到最小。

WGA技術(shù)的應(yīng)用
使用REPLI-g擴(kuò)增后的基因組DNA適于進(jìn)行多種多樣的后續(xù)應(yīng)用，包括：

• 使用TaqMan引物/探針套裝進(jìn)行SNP基因分型
• 基于qPCR和PCR技術(shù)的突變檢測
• 二代測序
• STR/微衛(wèi)星序列分析
• Sanger測序
• RFLP和Southern印跡分析
• 如比較基因組雜交一類的芯片分析技術(shù)

以上信息來源于QIAGEN:

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