RNA實(shí)驗(yàn)方案和應(yīng)用（一）

RNA是具有多種不同的功能的生物大分子。信使RNA（mRNA）是DNA轉(zhuǎn)錄得到的，用做蛋白質(zhì)合成的模板。蛋白質(zhì)的合成是由核糖體完成的，核糖體由核糖體RNA（rRNA）和蛋白質(zhì)組成。用于蛋白合成的氨基酸，是通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA）輸送到核糖體上的。RNA分子也是參與RNA轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程的核糖蛋白的一部分。非編碼RNA也是非常重要的。它們是不翻譯成蛋白質(zhì)的功能RNA分子。這樣的RNA分子包括tRNA、rRNA、核仁小RNA（snoRNA）、微小RNA（miRNA）、小干擾RNA和piwi-interacting RNA（piRNA）。它們通常在基因表達(dá)的調(diào)控中發(fā)揮作用。

miRNA是一類(lèi)內(nèi)源性的（自然產(chǎn)生的），約18–24個(gè)核苷酸大小的非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后的基因調(diào)控中發(fā)揮作用。一個(gè)miRNA可能在每個(gè)細(xì)胞中有超過(guò)105個(gè)拷貝，但是從每個(gè)細(xì)胞中總RNA質(zhì)量的角度來(lái)看，這些RNA又是微不足道的。由于它們非常短，因此通常需要特別的分離和分析方案。

一個(gè)典型的快速生長(zhǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中,每個(gè)細(xì)胞大約含有10–30 pg的RNA，而一個(gè)完全分化的原代細(xì)胞中，RNA的量要少得多——大約每個(gè)細(xì)胞中RNA的含量小于1 pg。細(xì)胞中的RNA分子主要是tRNA和rRNA。mRNA大約占細(xì)胞中RNA總量的1–5%，但是具體的量取決于細(xì)胞類(lèi)型和細(xì)胞的生理狀態(tài)。一個(gè)動(dòng)物細(xì)胞中，大約有360,000個(gè)mRNA分子，組成了大約12,000個(gè)轉(zhuǎn)錄本，一個(gè)典型轉(zhuǎn)錄本的長(zhǎng)度大約為2 kb。一些mRNA分子占到了總mRNA的3%，而其它的mRNA分子的含量低于0.01%。這些“稀有的”或者“低豐度”的mRNA分子在每個(gè)細(xì)胞中只有5–15個(gè)拷貝。但是，這些稀有的mRNA大約有11,000種，占到了mRNA數(shù)量的45%。

一個(gè)生物體中的基因是相對(duì)固定的，因此，mRNA的組成代表了在給定的條件下，基因的表達(dá)方式。使用雜交技術(shù)，包括RNA印跡法（northern印跡）和微陣列分析，或RT-PCR技術(shù)、轉(zhuǎn)錄本測(cè)序技術(shù)（RNA-seq）對(duì)RNA進(jìn)行分析，能夠充分反映一個(gè)生物體中的基因表達(dá)譜。但是，與DNA相比，RNA相對(duì)不穩(wěn)定。這很大程度上是由于存在會(huì)降解RNA分子的核糖核酸酶(RNases)。

核糖核酸酶非常的穩(wěn)定，不需要輔因子，在非常低濃度的時(shí)候就有很高的催化效率，并且不容易失活。核糖核酸酶的污染可以來(lái)自于人類(lèi)的皮膚和攜帶有細(xì)菌和霉菌的塵埃顆粒。因此，RNA的分離和分析需要特別的技術(shù)。

* 由于物種、發(fā)育階段和生長(zhǎng)條件的不同，含量有可能不同。

小RNA（miRNA）是一類(lèi)內(nèi)源性的（自然產(chǎn)生的），約22個(gè)核苷酸的非編碼RNA分子，它們參與轉(zhuǎn)錄后的基因調(diào)控。它們與siRNA分子具有類(lèi)似的特征。

miRNA分子在很多生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，包括細(xì)胞的分化和發(fā)育，細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和對(duì)感染的應(yīng)答等。大量的證據(jù)顯示，miRNA表達(dá)的紊亂是一些疾病發(fā)生的原因和標(biāo)志，包括多種癌癥。在血清和血漿中可檢測(cè)到無(wú)細(xì)胞的miRNA分子，而疾病會(huì)導(dǎo)致它們表達(dá)水平變化。這些發(fā)現(xiàn)，使得無(wú)細(xì)胞miRNA的表達(dá)很可能作為疾病診斷和預(yù)防中的生物標(biāo)志物。

miRNA和siRNA的途徑都與雙鏈RNA相關(guān)，但是這些RNA分子的來(lái)源不同。與誘導(dǎo)RNA干擾的雙鏈RNA不同，miRNA是由基因組編碼的。除此之外，miRNA的前體（pre-miRNA）不完全是雙鏈的，而是包含有雙鏈區(qū)域的發(fā)卡結(jié)構(gòu)。與RNAi不同（參考RNAi），miRNA的作用主要是調(diào)節(jié)細(xì)胞自己的基因。人類(lèi)具有超過(guò)2000種miRNA分子，據(jù)估計(jì)，它們調(diào)節(jié)超過(guò)三分之二的人類(lèi)基因。

miRNA系統(tǒng)是調(diào)節(jié)基因表達(dá)的內(nèi)源性機(jī)制。成熟的miRNA分子，主要通過(guò)翻譯抑制來(lái)調(diào)控內(nèi)源性基因的表達(dá)。除此之外，miRNA能通過(guò)快速的脫腺苷化作用和去除帽子來(lái)摧毀mRNA。自然生成的miRNA分子的結(jié)合位點(diǎn)，通常在目標(biāo)mRNA 3’端的非翻譯區(qū)。在動(dòng)物的miRNA分子中，序列的部分匹配給確定真正的結(jié)合位點(diǎn)帶來(lái)困難，并且降低了結(jié)合位點(diǎn)確定的準(zhǔn)確性。

miRNA 模擬物是化學(xué)合成的，雙鏈RNA分子（通常長(zhǎng)度為18–24個(gè)核苷酸），通過(guò)轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，模擬成熟的內(nèi)源性miRNA分子。miRNA抑制劑是單鏈（通常長(zhǎng)度為21–25個(gè)核苷酸），經(jīng)過(guò)修飾的RNA分子，通過(guò)轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，特異性的抑制miRNA的功能。模擬物和抑制劑包含一些化學(xué)修飾，以便提高活性或者增強(qiáng)其在體內(nèi)的穩(wěn)定性。

通過(guò)將miRNA模擬物轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，并進(jìn)行下游的基因表達(dá)分析或者表型分析，可以闡明特定miRNA分子的目標(biāo)和發(fā)揮的作用。這些實(shí)驗(yàn)可以研究單個(gè)miRNA錯(cuò)誤調(diào)節(jié)所造成的生物學(xué)影響，也能用于確定某個(gè)miRNA分子的特異性靶標(biāo)基因。miRNA轉(zhuǎn)染之后，如果降低或者提高基因的表達(dá)水平，說(shuō)明研究的miRNA參與調(diào)節(jié)了這個(gè)基因的表達(dá)。類(lèi)似的，miRNA在很多通路中的作用，都可以通過(guò)檢測(cè)miRNA模擬物或者抑制劑轉(zhuǎn)染之后的特定表型來(lái)研究。

miRNA模擬物/抑制劑轉(zhuǎn)染對(duì)于下游應(yīng)用的影響，通�？梢酝ㄟ^(guò)如下方案來(lái)分析：

• 攜帶有報(bào)告基因，比如熒光素酶，和一個(gè)或者多個(gè)位于3’端非翻譯區(qū)的miRNA結(jié)合位點(diǎn)的質(zhì)粒載體做為miRNA的靶標(biāo)。miRNA的模擬物/抑制劑與載體共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。在轉(zhuǎn)染之后，進(jìn)行報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，比如熒光素酶檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。通過(guò)將上述轉(zhuǎn)染的結(jié)果與只轉(zhuǎn)染質(zhì)粒載體的結(jié)果比較，確定miRNA模擬物和抑制劑的影響。
• 將miRNA的模擬物/抑制劑轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，然后檢測(cè)相關(guān)的內(nèi)源性基因（即所研究的miRNA分子的靶標(biāo)）的表達(dá)。通過(guò)將結(jié)果與未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞或者轉(zhuǎn)染了陰性對(duì)照的細(xì)胞的表達(dá)結(jié)果相比，可以確定miRNA模擬物/抑制劑的作用。由于miRNA通常抑制目標(biāo)基因的翻譯，而不降解目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄本，因此，一般通過(guò)檢測(cè)蛋白的表達(dá)水平來(lái)確定基因的表達(dá)水平，比如通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法。這意味著miRNA模擬物/抑制劑的影響通常不能通過(guò)定量的real-time PCR 來(lái)檢測(cè)。

siRNA

小干擾RNA（通常稱(chēng)做siRNA）參與多種生物學(xué)過(guò)程——最常見(jiàn)的是RNA干擾或者RNAi。

大多數(shù)RNA是單鏈的，但是，siRNA由兩條互補(bǔ)的核酸鏈組成，與DNA類(lèi)似。siRNA的長(zhǎng)度大約為20–25個(gè)核苷酸。siRNA在RNAi過(guò)程中扮演了重要角色，它們通過(guò)互補(bǔ)的核苷酸序列來(lái)干擾特定基因的表達(dá)。

長(zhǎng)度為21個(gè)核苷酸的雙鏈siRNA分子的一些近似值：

• 20 µM的siRNA相當(dāng)于濃度大約為0.25 µg/µl
• 長(zhǎng)度為21個(gè)核苷酸的siRNA的分子量大約為13–15 µg/nmol

RNAi

RNA干擾（或者RNAi）是細(xì)胞中的一種自然發(fā)生的過(guò)程，它能夠關(guān)閉或者沉默特定基因的活性。RNA干擾于1998年被發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)在已經(jīng)是研究基因功能的強(qiáng)大工具。

RNAi通過(guò)干擾信使RNA（mRNA）所攜帶的信息發(fā)揮作用，從而抑制蛋白的合成。mRNA失去活性，基因也就失活了。

誘導(dǎo)RNAi的雙鏈RNA分子（siRNA），在進(jìn)入細(xì)胞之后，被Dicer酶切割成小的片段。這些小的片段，作為引導(dǎo)物，引導(dǎo)siRNA與具有互補(bǔ)序列的mRNA相結(jié)合。然后，這些細(xì)胞內(nèi)的mRNA被切割，從而有效地破壞了它們所攜帶的信息，并且沉默相應(yīng)基因的表達(dá)。

RNAi的過(guò)程相當(dāng)復(fù)雜。雙鏈RNA被RNase III識(shí)別，然后切割成21–23個(gè)核苷酸大小的siRNA分子。這些siRNA分子參與組成了稱(chēng)做RISC（RNA-induced silencing complex，RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物）的RNAi靶標(biāo)復(fù)合物，這些復(fù)合物能夠破壞與siRNA同源的mRNA分子。靶標(biāo)mRNA分子在其與siRNA分子序列互補(bǔ)區(qū)域的中心處被切割，然后導(dǎo)致靶標(biāo)mRNA分子被降解，降低了蛋白的表達(dá)。

使用siRNA

siRNA分子是RNAi過(guò)程中的主要效應(yīng)因子，可以通過(guò)化學(xué)方法或者酶催化的方法在體外合成。siRNA的序列設(shè)計(jì)對(duì)于有效的基因沉默是非常關(guān)鍵的，它們的設(shè)計(jì)方法是基于對(duì)RNAi過(guò)程的理解，以及對(duì)天然存在的siRNA分子的功能的理解，開(kāi)發(fā)出來(lái)的。

siRNA的輸送對(duì)于基因沉默實(shí)驗(yàn)是至關(guān)重要的。合成的siRNA分子可以通過(guò)電穿孔或者親脂的試劑，輸送到細(xì)胞內(nèi)。但是，這兩種方法都是暫時(shí)的。質(zhì)粒系統(tǒng)能夠用于表達(dá)短發(fā)卡RNA（shRNA）分子，它們是Dicer酶的底物，在體內(nèi)能成熟成為siRNA分子。這樣的系統(tǒng)能穩(wěn)定地抑制目標(biāo)基因的表達(dá)。也有一些病毒輸送系統(tǒng)，能夠?qū)�shRNA輸送到難于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系中。

RNAi實(shí)驗(yàn)原理及流程

以上信息來(lái)源于QIAGEN官網(wǎng)：