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核糖核酸酶(RNase)是非常穩(wěn)定、活躍的酶,它們通常不需要輔因子就能發(fā)揮功能。由于核糖核酸酶難以失活,并且很小的量就足以破壞RNA分子,因此在沒有事先消除任何可能的核糖核酸酶污染的情況下,不要使用任何塑料或者玻璃器皿。處理RNA時(shí)應(yīng)非常小心,以避免在純化的過程中或者純化之后,將核糖核酸酶無意的引入到RNA樣品中。為了創(chuàng)造并維持沒有核糖核酸酶的環(huán)境,在預(yù)處理以及使用一次性和非一次性的器皿和溶液處理RNA時(shí),一定要采取以下預(yù)防措施。 常規(guī)操作 處理RNA時(shí),一定要使用合適的微生物學(xué)的無菌技術(shù)。手和灰塵顆?赡軙(huì)攜帶細(xì)菌和霉菌,是最常見的核糖核酸酶污染源。為了阻止來源于皮膚表面或者實(shí)驗(yàn)室器械灰塵上的核糖核酸酶污染,在操縱試劑以及RNA樣品的時(shí)候,一直要佩戴乳膠手套或者乙烯基手套(PVC手套)。可能的情況下,要經(jīng)常更換手套,并將試管處于關(guān)閉狀態(tài)。當(dāng)用移液管吸取溶液用于下游應(yīng)用時(shí),要將純化過的RNA放在冰上。 為了去除工作臺(tái)表面、非一次性塑料器皿和實(shí)驗(yàn)室器械(比如,移液管和電泳槽)上的核糖核酸酶污染,推薦使用市售核糖核酸酶去除溶液。也可以使用常見的實(shí)驗(yàn)室試劑去除核糖核酸酶的污染。為了去除塑料器皿上的污染,使用0.1 M NaOH, 1 mM EDTA洗滌,然后使用去RNase的水洗滌;如果塑料器皿具有耐氯仿性,則可用氯仿洗滌。為了去除電泳槽的污染,可使用去污劑清潔(比如,0.5%的SDS),使用去RNase的水洗滌,然后用乙醇洗滌(如果電泳槽具有耐乙醇性),之后晾干。 重要:在使用化學(xué)試劑時(shí),一定要穿戴合適的實(shí)驗(yàn)工作服,一次性的手套,以及具有護(hù)目鏡。請(qǐng)參考產(chǎn)品廠商提供的相應(yīng)安全數(shù)據(jù)說明書(SDS),了解更多信息。 一次性塑料耗材 在處理RNA的時(shí)候,推薦使用無菌的,一次性的聚丙烯管。這些試管通常沒有核糖核酸酶,因此不需要預(yù)處理使核糖核酸酶失活。 非一次性的塑料耗材 非一次性的塑料耗材在使用之前應(yīng)該進(jìn)行處理,以確保其不含有核糖核酸酶。塑料耗材應(yīng)該嚴(yán)格的使用0.1 M NaOH、1 mM EDTA洗滌,然后用去RNase的水洗滌。具有耐氯仿性的塑料耗材可以使用氯仿洗滌,以使核糖核酸酶失活。 玻璃器皿 玻璃器皿在使用之前,應(yīng)該進(jìn)行處理,以確保其不含有核糖核酸酶。用于處理RNA的玻璃器皿在使用之前,應(yīng)該使用去污劑清潔,嚴(yán)格的洗滌,并在240°C的烘箱中烘烤至少4小時(shí)(如果更方便的話,可以過夜)。也可以使用DEPC(焦碳酸二乙酯)處理玻璃器皿。使用0.1%的DEPC(0.1%的水溶液)充滿玻璃器皿,在37°C的條件下過夜(12小時(shí)),然后使用高壓釜處理或者加熱到100°C 15分鐘,以去除剩余的DEPC。 重要:在使用化學(xué)試劑時(shí),一定要穿戴合適的實(shí)驗(yàn)工作服,一次性的手套以及護(hù)目鏡。請(qǐng)參考產(chǎn)品廠商提供的安全數(shù)據(jù)說明書(SDS),了解更多信息。 電泳槽 電泳槽應(yīng)使用去污劑(比如,0.5%的SDS)清潔,嚴(yán)格的用去RNase的水洗滌,然后使用乙醇洗滌,之后晾干。 重要:在使用化學(xué)試劑時(shí),一定要穿戴合適的實(shí)驗(yàn)工作服,一次性的手套以及護(hù)目鏡。請(qǐng)參考產(chǎn)品廠商處提供的相應(yīng)安全數(shù)據(jù)說明書(SDS),了解更多信息。 重要:一些電泳槽使用的塑料不具有耐乙醇性,需要仔細(xì)查閱廠商說明書。 溶液 溶液(水或者其它溶液)應(yīng)該使用0.1%的DEPC處理。DEPC是一種強(qiáng)大但非絕對(duì)的RNase抑制劑,它通過共價(jià)修飾RNase發(fā)揮作用。 重要:在使用化學(xué)試劑時(shí),一定要穿戴合適的實(shí)驗(yàn)工作服,一次性的手套以及護(hù)目鏡。請(qǐng)參考產(chǎn)品廠商提供的相應(yīng)安全數(shù)據(jù)說明書(SDS),了解更多信息。 | |||||||||||||||||||||||||||
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溶液(水或者其它溶液)應(yīng)該使用0.1%的DEPC處理。DEPC是一種強(qiáng)大但非絕對(duì)的RNase抑制劑。濃度為0.1%的DEPC經(jīng)常用于處理玻璃或者塑料耗材,以使其表面的RNase失活,或者制備不含RNase的的溶液和水。DEPC通過共價(jià)修飾使RNase失活。在100 ml要處理的溶液中加入0.1 ml DEPC,大力的搖晃,以使DEPC充分進(jìn)入溶液。將溶液在37°C的條件下孵育12個(gè)小時(shí)。在高壓滅菌器內(nèi)處理15 min以去除任何DEPC的痕跡。DEPC與伯胺發(fā)生反應(yīng),因此不能直接用于處理Tris緩沖液。在Tris緩沖液存在的條件下,DEPC非常不穩(wěn)定,迅速分解為乙醇和CO2。在制備Tris緩沖液時(shí),應(yīng)先使用DEPC處理水,然后將Tris溶解以制備合適的緩沖液。痕量的DEPC會(huì)通過乙酰基化作用,與RNA分子中的嘌呤殘基反應(yīng),將其修飾。在細(xì)胞外的環(huán)境中,乙;腞NA分子以很低的效率被翻譯。但是,除非有大量的嘌呤殘基被修飾了,否則不會(huì)嚴(yán)重的影響這些RNA分子雜交形成DNA:RNA或者RNA:RNA雜交物的能力。溶液或者器皿上殘留的DEPC,一定要在高壓滅菌器中處理或者加熱到100°C處理15 min,以便除去。 重要:在使用化學(xué)試劑時(shí),一定要穿戴合適的實(shí)驗(yàn)工作服,一次性的手套以及護(hù)目鏡。請(qǐng)參考產(chǎn)品廠商提供的相應(yīng)安全數(shù)據(jù)說明書(SDS),了解更多信息。 | |||||||||||||||||||||||||||
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為了確保基因表達(dá)分析的精確性,所分析的RNA應(yīng)能夠準(zhǔn)確地反映出其在生物樣本中的體內(nèi)表達(dá)情況。但實(shí)際在樣本的操作和RNA的分離過程中,RNA很容易發(fā)生改變而使情況變得復(fù)雜。 生物樣本一經(jīng)提取,其中的RNA即變得極不穩(wěn)定。期間所發(fā)生的人為影響主要分成兩種;虻南抡{(diào)和RNA的酶促降解會(huì)導(dǎo)致mRNA特異性或非特異地發(fā)生人為降低。同時(shí)在操作和加工樣本的過程中,某些基因會(huì)被誘導(dǎo)表達(dá)。這兩種效應(yīng)的綜合可能在檢出的轉(zhuǎn)錄譜與體內(nèi)真實(shí)情況之間造成偏差。 對(duì)RNA表達(dá)譜進(jìn)行即刻的穩(wěn)定化處理是精確基因表達(dá)分析中的首要事項(xiàng)。通常情況下,用于RNA分析的樣本被迅速置于液氮中冷凍,在進(jìn)一步處理之前一直儲(chǔ)存于–80°C下。產(chǎn)品供應(yīng)商也提供了一些穩(wěn)定處理試劑,作為替代方法對(duì)生物樣本中的RNA進(jìn)行穩(wěn)定化處理。這些供應(yīng)商提供了集成化的樣本處理溶液(套裝),其中包括容器,穩(wěn)定處理試劑及制備試劑盒
來自參考文獻(xiàn)2。換算為核酸:RNA RNA分子量和摩爾換算
* mRNA平均長(zhǎng)度為1930個(gè)核苷酸。 以上信息來源于QIAGEN 官網(wǎng): |
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