RNA實(shí)驗(yàn)和方案新手必讀（三）

起始材料的有效破碎和勻漿對于所有總RNA分離操作來說都是必須的要求。破碎和勻漿是兩個獨(dú)立分開的步驟。

• 破碎：對于組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)膜的徹底破碎對于釋放樣本中所有的RNA是絕對必要的。不同樣本需要使用不同的方法以達(dá)到徹底的破碎效果。不完全的破碎會導(dǎo)致RNA得率的顯著降低。
• 勻漿：勻漿對于減少破碎后細(xì)胞裂解產(chǎn)物的粘性是十分必要的。勻漿能夠切斷高分子量的基因組DNA及其他高分子量的細(xì)胞組分，得到均勻的裂解產(chǎn)物。勻漿不夠徹底會導(dǎo)致RNA結(jié)合效率的下降而顯著降低得率。

某些破碎方法能夠同時對樣本起到勻漿作用，而其他方法還是需要專門的勻漿步驟。表針對不同樣本進(jìn)行破碎和勻漿的準(zhǔn)則全面概述了適用于多種起始材料的不同破碎和勻漿方法。當(dāng)您針對所使用的起始材料選擇合適的操作方法時，該表格可用來作為參考。下面也將針對破碎和勻漿方法進(jìn)行更為詳細(xì)的論述。

使用玻珠研磨機(jī)進(jìn)行破碎和勻漿

在使用玻珠研磨機(jī)破碎樣本的過程中，樣本與珠子被一起進(jìn)行高速攪拌。通過珠子與細(xì)胞碰撞時的流體動力切割和破碎作用，同步完成破碎和勻漿過程。破碎效率的影響因素有：

• 珠子的大小和組成
• 緩沖液與珠子的比例
• 起始樣本的數(shù)量
• 攪拌速度和設(shè)定
• 處理時間

細(xì)菌破碎時所使用的理想珠型為0.1毫米（平均直徑）的玻璃珠，用于酵母和單細(xì)胞動物細(xì)胞時為0.5毫米的玻璃珠，對動植物組織則應(yīng)使用3–7毫米的不銹鋼珠。請確保玻璃珠經(jīng)過濃硝酸的預(yù)先潤洗。或者可直接購買和使用市售的經(jīng)酸洗滌過的玻璃珠。關(guān)于破碎的其他參數(shù)需要依據(jù)每一應(yīng)用的經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行設(shè)定。植物材料以及相關(guān)的珠子和破碎管可先在液氮中預(yù)冷，破碎應(yīng)在無裂解緩沖液的條件下進(jìn)行。對于動物組織則應(yīng)使用干燥的冷凍粉碎。冷凍粉碎（無論是在玻珠研磨機(jī)中還是使用研缽和杵）不同于緩沖液裂解，不會對樣本同時起到勻漿作用。

使用轉(zhuǎn)子——定子勻漿器進(jìn)行破碎和勻漿

在裂解緩沖液的存在下，轉(zhuǎn)子–定子勻漿機(jī)可同時完成對動物組織的徹底破碎和勻漿，所需時間基于樣本的堅韌程度，可在5–90秒內(nèi)完成。轉(zhuǎn)子–定子勻漿機(jī)也可以用于細(xì)胞裂解產(chǎn)物的勻漿。轉(zhuǎn)子的超高速旋轉(zhuǎn)能夠以擾動和機(jī)械剪切的綜合方式，完成對樣本的破碎和勻漿。使用適當(dāng)大小的管子，在勻漿過程中始終保證勻漿器頭部一直處于浸沒狀態(tài)，并持續(xù)將勻漿器頭部伸入管子末端，以確保勻漿過程中樣本內(nèi)的泡沫達(dá)到最少。轉(zhuǎn)子–定子勻漿機(jī)有不同大小型號可供選擇，并可裝配不同大小的探頭。5 mm和7 mm的探頭適合在300 µl以下的體積內(nèi)使用，并可用于離心管內(nèi)的勻漿。10 mm及以上尺寸的探頭則適用于更大的管子。

使用研缽和杵破碎

使用研缽和杵破碎時，先將樣本進(jìn)行迅速的液氮冷凍，并在液氮中將其研磨為細(xì)粉。將上清液（組織粉末和液氮）轉(zhuǎn)移至液氮預(yù)冷的適當(dāng)大小的管中，使液氮揮發(fā)但不要讓樣品融解。加入裂解緩沖液，并盡可能快地進(jìn)行后續(xù)步驟。

注：使用研缽和杵研磨樣品會破碎樣品，但無法達(dá)到勻漿的目的。勻漿作用需與此步驟分開進(jìn)行。

使用注射器和針頭完成勻漿

細(xì)胞和組織的裂解產(chǎn)物可以使用注射器和針頭進(jìn)行勻漿�？梢允褂�20號（0.9 mm）針頭連接一個滅菌塑料注射器，通過至少5–10次的吹打切斷高分子量的DNA，直至裂解產(chǎn)物的勻漿形成。為操作便利和減少樣品損失，也可能需要增加裂解緩沖液的體積。

一些樣本來源在其RNA或內(nèi)含物方面存在著顯著不同，可能導(dǎo)致RNA的分離和分析過程出現(xiàn)問題。當(dāng)操作這些樣本來源時需要一些特別注意事項。本節(jié)將針對大量不同樣本來源的操作進(jìn)行探討。

植物

從植物材料中分離RNA會遇到一些特殊困難，常規(guī)技術(shù)在用于植物樣本之前一般要先經(jīng)過條件優(yōu)化。一些植物代謝產(chǎn)物的化學(xué)性質(zhì)與核酸相似，導(dǎo)致其難于從RNA制備產(chǎn)物中除去。（使用不當(dāng)?shù)模┘兓�方法（如鹽類或苯酚）所導(dǎo)致的代謝物（例如多糖類、多酚類和黃酮類）或污染物與目的RNA的共分離，可能造成對酶促反應(yīng)的抑制，或?qū)е伦贤夥止夤舛葴y定和凝膠電泳結(jié)果上的偏差。從植物材料中分離RNA的過程中可能遇到的困難還包括由于較高粘性導(dǎo)致的吸取體積錯誤，以及儲存過程中的RNA降解問題。

通常對植物的生長條件進(jìn)行優(yōu)化，使其不產(chǎn)生高水平的植物代謝產(chǎn)物，可有助于對RNA的有效分離。由于植物種類之間存在較大差異，因此對其生長條件很難有同一的指導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)。不過作為普適原則，建議盡可能使用健康幼嫩的植物組織。年輕植物組織的RNA得率通常高于年老組織，因?yàn)榍罢咴诘戎貤l件下通常比后者包含更多的細(xì)胞。而且等重的年輕組織通常也包含更少的代謝物。此外，許多“自定義”的RNA分離方法都推薦將植物組織在黑暗中培養(yǎng)1–2天后再進(jìn)行收獲，以避免形成植物代謝物的高水平積累。

心臟、肌肉和皮膚組織

從例如骨骼肌、心臟和皮膚組織一類的樣本中分離RNA可能比較困難，因?yàn)榇祟悩悠分泻�有大量的收縮性蛋白、結(jié)締組織和膠原。為了去除這些可能對RNA分離造成干擾的蛋白，需要使用蛋白酶或含苯酚的裂解試劑對此類樣本進(jìn)行處理。不過，蛋白酶的消化過程需要避免RNA發(fā)生降解。

細(xì)菌

細(xì)菌mRNA的很多基本特征都不同于真核生物的mRNA。原核生物的mRNA沒有5’帽子，也很少具有poly A尾。缺少poly A尾的mRNA無法通過雜交進(jìn)行捕獲。另外，也無法在合成初始鏈的過程中使用寡聚脫氧胸腺嘧啶核苷（oligo–dT）引物，只能使用隨機(jī)引物作為替代。

此外，細(xì)菌RNA也十分地不穩(wěn)定，快速生長的品種中RNA的平均半衰期約為3分鐘。某些細(xì)菌的mRNA在翻譯同時即發(fā)生降解。因此對于嘗試從細(xì)菌中分離mRNA的研究人員來說，這可算是一個大麻煩。也由于細(xì)菌中的mRNA的周轉(zhuǎn)（從生成到降解）非�？�，造成原核生物的基因表達(dá)研究比真核生物更為困難。為了精確地保留基因表達(dá)譜，并使完好mRNA的得率最大化，在樣本獲取和加工之前需要對其進(jìn)行穩(wěn)定處理。

血液

血液直接源于臨床分析的收集樣本。在收集管中使用RNA穩(wěn)定處理試劑可成功保存血液樣本的RNA。從血液中分離RNA的方法，需要能夠確保生成無污染物或酶抑制劑的高質(zhì)量RNA。血液中所含有的大量酶抑制劑會對下游的RNA分析造成干擾。此外，如肝素和EDTA等一類常規(guī)的抗凝血劑也會干擾下游分析。應(yīng)注意抗凝血劑并不會對RNA起到穩(wěn)定化作用。

人類血液中的紅血球（血紅細(xì)胞）不含細(xì)胞核，因此不會合成RNA；通常情況下這類細(xì)胞僅含有非常微量的RNA，而不是RNA分離的主要對象。從全血中分離RNA的主要靶標(biāo)細(xì)胞為白血球（白細(xì)胞），這類細(xì)胞含有細(xì)胞核和RNA。白血球由三種主要的細(xì)胞類型構(gòu)成：淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞。

由于健康的血液中所含的紅細(xì)胞數(shù)量約為白細(xì)胞的1000倍，去除紅細(xì)胞會有助于簡化RNA分離步驟�？赏ㄟ^選擇性地裂解紅細(xì)胞來達(dá)到此目的，因?yàn)榧t細(xì)胞對低滲休克更為敏感（相比白血球），在低滲緩沖液中會迅速發(fā)生破裂。

裂解紅細(xì)胞的另一種常見替代方法是Ficoll密度——梯度離心法。與紅血球裂解法不同，F(xiàn)icoll密度——梯度離心法僅獲取單核的細(xì)胞（淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞），而會去除粒細(xì)胞。經(jīng)Ficoll密度––梯度離心法分離出的單核細(xì)胞能夠使用與其他動物細(xì)胞一樣的方法進(jìn)行RNA分離。

FFPE組織樣品

福爾馬林固定，石蠟包埋(FFPE)的組織樣本是生物醫(yī)學(xué)研究中的重要和廣泛的樣本來源。越來越多的研究者開始針對FFPE樣本開始分子水平的分析，因此考慮這些樣本的獨(dú)特屬性以發(fā)展針對性的分離方法變得越來越重要。

由于在固定和包埋過程中使用了甲醛，通常會使FFPE樣本中的核酸發(fā)生嚴(yán)重的片段化和化學(xué)改變。因此，從FFPE樣本中分離到的核酸會比新鮮樣本或冰凍樣本的分子量更低。其片段化程度基于樣本類型、保存期長短，以及固定、包埋和儲存的條件而發(fā)生變化。盡管在凝膠電泳或芯片實(shí)驗(yàn)室（lab–on–a–chip）分析等標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量控制分析中無法測得甲醛修飾情況，但后者實(shí)際會對酶學(xué)分析造成嚴(yán)重干擾。

為了將FFPE儲存法對RNA轉(zhuǎn)錄物的影響降至最低，應(yīng)牢記下列小貼士：

• 盡可能快地取樣和固定組織
• 不要使用厚度超過5 mm的樣本，樣本固定時間不宜過長（最長24小時）
• 使用優(yōu)質(zhì)的試劑進(jìn)行石蠟包埋，不要加入其它添加劑
• 盡可能避免對樣本進(jìn)行染色
• 適當(dāng)?shù)貎Υ鍲FPE樣本（RNA在4°C可完好保存至1年，優(yōu)于保存在室溫或更高溫度）
• 使用適當(dāng)?shù)拿撌�蠟步驟
• RNA分離應(yīng)包含一個解交聯(lián)的步驟

純RNA可以儲存在–20°C或–70°C的不含RNase的水中。在上述條件下，1年內(nèi)都不會發(fā)生RNA降解。

以上信息來源于QIAGEN官網(wǎng)：