體外細胞原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)實驗步驟（2）注意事項

三、實驗結果計算

1.一只小鼠可獲得（1～2.5）×108個脾細胞。

2.細胞接種后一般幾小時內就能貼壁，并開始生長，如接種的細胞密度適宜，5天到一周即可形成單層。

3.一般情況，傳代后的細胞在2小時左右就能附著在培養(yǎng)瓶壁上，2～4天就可在瓶內形成單層，需要再次進行傳代。

四、注意事項

1.取材要求新鮮，無菌，解剖小鼠時，注意不要損傷脾臟及其周圍的臟器，尤其是腸道等，防止污染脾臟。

2.沖洗脾臟時要盡量洗凈血污，去除無用組織，并要防止組織干燥。

3.碾磨后及時用清水沖洗篩網，防止組織、細胞阻塞網孔。

4.計數前，注意吸盡平皿里的細胞，充分混勻，使細胞分散成單個細胞。

5.實驗操作應在操作臺中央無菌區(qū)域內進行，勿在邊緣非無菌區(qū)域操作。

6.金屬器械不能在火焰中燒的時間過長，燒過的金屬鑷要待冷卻后才能挾取組織，以免造成組織損傷。

7.另外膠塞過火焰時也不能時間長，以免燒焦產生有毒氣體，危害培養(yǎng)細胞。

8.吸取過營養(yǎng)液后的吸管不能再用火焰燒灼，因殘留在吸管頭中營養(yǎng)液能燒焦形成炭膜，再用時會把有害物帶入營養(yǎng)液中。

9.不能用手觸及已消毒器皿瓶口、瓶塞內部，吸管前部等所有可能與細胞接觸的部分，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。

10.開啟、關閉長有細胞的培養(yǎng)瓶時，火焰滅菌時間要短。防止因溫度過高燒死細胞。

11.換液時傾倒廢液，瓶口不能接觸廢液缸，速度不能過快，防止廢液四濺。

12.吹打細胞時，要注意邊角的細胞是否吹打下來。

13.手或相對較臟的物品不能經過開放的瓶口上，即不可以在開放容器上方操作。

14.每次操作只處理一株細胞，以免造成細胞交叉污染。

15.注意自身的安全，對于來自人源性或病毒感染的細胞株應特別小心。操作過程中，應避免引起氣溶膠的產生，小心有毒性試劑例如DMSO，并避免尖銳物品傷人等。

16.從增殖期到形成致密的單層細胞以前的培養(yǎng)細胞都可以用于凍存，但最好為對數生長期細胞。在凍存前一天最好換一次培養(yǎng)液。

17.將凍存管放入液氮容器或從中取出時，要做好防護工作，以免凍傷。

18.凍存和復蘇最好用新配制的培養(yǎng)液。