對蝦白斑綜合癥病毒（WSSV）核酸檢測試劑盒（一管式PCR-熒光探針法）使用說明

對蝦白斑綜合癥病毒（WSSV）核酸檢測試劑盒（一管式PCR-熒光探針法）

◆ 產(chǎn)品說明 

動物病害檢測系列可針對食品、動物組織等樣品中病原的特異核酸片段進行擴增，通過實時擴增曲線判定結(jié)果。本產(chǎn)品用于對對蝦白斑綜合癥病毒（WSSV）的檢測，檢出限為10³copies/μL基因組DNA。

• 產(chǎn)品組成（96測試）

• 適用儀器

ABI 7500、CFX 96、Mx 3005P、LineGene9600等實時熒光PCR儀。

◆ 自備耗材和儀器

    ①冰盒；②移液器（0.5-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套滅菌吸頭；③離心機；④渦旋混勻器；⑤金屬��；⑥均質(zhì)機、攪拌機或研缽等研磨器具；⑦電子天平。

◆ 注意事項

1．本試劑檢測靈敏度高。為了防止污染，實驗要分區(qū)操作。

   1）第一區(qū)：樣本制備區(qū)。

 2）第二區(qū)：模板添加區(qū)。

   3）第三區(qū)：擴增及產(chǎn)物分析區(qū)。

   ★ 分區(qū)之間最好進行物理性隔離，避免人為因素造成的污染。

2．實驗過程中穿戴工作服和乳膠手套，不同區(qū)域獨立使用工具，需更換手套和實驗服。

3．嚴(yán)格按照操作步驟操作，試劑配制和加樣等步驟請嚴(yán)格按照說明書要求在冰盒上操作。

4．反應(yīng)液中的成分對光敏感，應(yīng)避光保存。試劑使用前要完全解凍，但應(yīng)避免反復(fù)凍融，推薦使用前離心30秒，并按檢測頻次將反應(yīng)液以適當(dāng)體積分管保存。

5．反應(yīng)結(jié)束后，擴增管請置于密封袋內(nèi)丟棄，當(dāng)日清理，開蓋易造成氣溶膠污染，禁止開蓋。

6．不同批號試劑請勿混合使用，在有效期內(nèi)使用。

◆ 樣品處理

①樣品的采集和制備是對蝦白斑綜合癥病毒檢測的重要步驟，為防止交叉污染，應(yīng)使用一次性消耗品，研缽應(yīng)經(jīng)160℃干烤2 h，其他不宜干烤或高壓處理的器皿應(yīng)使用1%次氯酸鈉溶液浸泡。②優(yōu)先采集有癥狀的或活力差的個體。對于成蝦取鰓或上皮、肝胰腺、腸、胃、游泳足或步足等病灶部位，活力差的個體采集10-20尾/池，活力好的個體至少多點采集150尾/池后混勻再隨機抽檢10-20尾。對于幼蝦、仔蝦、幼體或受精卵取整體，活力差的個體至少采集20尾/池，活力好的蝦苗至少采集150尾/池。同一批樣品，建議多點采集合并后，作為一份樣品進行均質(zhì)，提取DNA。③采樣過程應(yīng)快速完成，將采取的樣品放入無菌均質(zhì)袋中均質(zhì)成糜狀，充分混勻。更多樣品前處理的注意事項可咨詢我司技術(shù)支持人員。

• 實驗操作

1.模板制備（樣本制備區(qū)）

建議使用配套水生動物病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒系列產(chǎn)品，具體過程詳見產(chǎn)品說明書。

2.添加模板（模板添加區(qū)，放置于冰盒上進行）

剪下所需測試數(shù)的已含有反應(yīng)液的PCR管，放置在室溫待解凍后，離心30秒后揭開封口膜，向每管反應(yīng)液中分別加入5μL模板，順序為NG、待測樣品模板、PG-VH-P。蓋好配套的PCR管蓋后，渦旋混勻30s，離心1min，立即進行PCR擴增反應(yīng)。

3. 擴增反應(yīng)（擴增及產(chǎn)物分析區(qū)）

使用熒光定量PCR儀，熒光基團選擇FAM，淬滅基團選擇TAMRA。

按下列條件設(shè)置擴增反應(yīng)：

其他儀器請參照儀器說明書進行設(shè)置。

• 結(jié)果判定

檢測樣品無Ct值或≥40，曲線為直線或輕微斜線，無“S”型擴增曲線，可報告樣品陰性，不含有對蝦白斑綜合癥病毒（WSSV）或含量低于檢出限；

檢測樣品Ct≤36，曲線呈“S”型擴增曲線，可直接報告樣品陽性，含有對蝦白斑綜合癥病毒（WSSV）；

檢測樣品36<Ct≤40，需進行一次重復(fù)實驗，若Ct值仍處于36和40之間且呈“S”型擴增曲線，同時陰性對照無Ct值，報告樣品陽性，否則報告樣品陰性。

• NG反應(yīng)為平滑直線，PG反應(yīng)為“S”型擴增曲線，此次檢測結(jié)果有效，否則無效。如重復(fù)檢測結(jié)果仍為無效，請與技術(shù)支持人員聯(lián)系。
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