沙門氏菌核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）使用說明書

沙門氏菌核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）

◆ 產(chǎn)品說明

 沙門氏菌核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）參照《SN/T 1870—2016 進(jìn)出口食品中食源性致病菌檢測方法 實(shí)時(shí)熒光PCR法》進(jìn)行設(shè)計(jì)，可針對增食品、飼料等樣品中沙門氏菌的特異核酸片段進(jìn)行擴(kuò)增，通過實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線判定結(jié)果。該產(chǎn)品檢出限為10³ cfu/ml（使用旋達(dá)071021M細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取1 ml 10³cfu/ml增菌液的細(xì)菌基因組DNA作為模板）。

◆ 產(chǎn)品組成（ 12測試）

011012S
試劑	含量
A-Sal-P	250μl
PG-Sal-P	25μl
NG	25μl

◆ 適用儀器

   ABI 7500，CFX 96，Mx 3005P，LineGene9600熒光定量PCR儀。

◆ 自備耗材和儀器

①滅菌1.5mL或2.0mL離心管；②滅菌0.2mL PCR管或八聯(lián)管；③冰盒；④移液器（11-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套滅菌吸頭；⑤離心機(jī)；⑥渦旋混勻器；⑦金屬浴；⑧均質(zhì)機(jī)、攪拌機(jī)或研缽等研磨器具；⑨電子天平。

◆ 注意事項(xiàng)

1．本試劑檢測靈敏度高。為了防止污染，實(shí)驗(yàn)要分區(qū)操作。

   1）第一區(qū)：試劑準(zhǔn)備區(qū)。

   2）第二區(qū)：樣本制備區(qū)。

   3）第三區(qū)：擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)。

   ★ 分區(qū)之間最好進(jìn)行物理性隔離，避免人為因素造成的污染。

2. 實(shí)驗(yàn)過程中穿戴工作服和乳膠手套，使用移液器，試驗(yàn)產(chǎn)生的所有廢棄物及時(shí)處理。

3．嚴(yán)格按照操作步驟操作，試劑配制和加樣等步驟請嚴(yán)格按照說明書要求在冰上操作。

4．反應(yīng)液中的成分對光敏感，應(yīng)避光保存。試劑使用前要完全解凍，但應(yīng)避免反復(fù)凍融，推薦使用前離心30秒，并按檢測頻次將反應(yīng)液以適當(dāng)體積分管保存。

5．反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增管請置于密封袋內(nèi)丟棄，當(dāng)日清理，開蓋易造成氣溶膠污染，禁止開蓋。

6．不同批號(hào)試劑請勿混合使用，在有效期內(nèi)使用。

◆ 樣品處理

參照《GB 4789.4-2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》進(jìn)行沙門氏菌的樣品制備、增菌培養(yǎng)和分離。

◆ 實(shí)驗(yàn)操作

將試劑完全解凍，各組分離心30s。

1. 試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)，放置于冰盒中進(jìn)行）：

若有N個(gè)待檢樣品，則參照下表，按照N+2個(gè)數(shù)量計(jì)算各組分用量（N個(gè)待檢樣品+1個(gè)陰性對照+1個(gè)陽性對照），將反應(yīng)液置于1.5ml或者2.0ml離心管中，漩渦混勻，離心30秒，分裝于0.2mL PCR管中。

試劑	使用量
A-Sal-P	20×(N+2)μl
反應(yīng)液總體積	20×(N+2)μl

1. 模板制備（樣本制備區(qū)）

建議使用試劑配套細(xì)菌組DNA提取系列產(chǎn)品，具體過程詳見產(chǎn)品說明書。

3．添加模板（樣本制備區(qū)，放置于冰盒中進(jìn)行）

    在步驟1中已含有反應(yīng)液的PCR管中加入5μl模板，順序?yàn)镹G、待測樣品模板、PG-Sal-P。渦旋混勻30s，離心1min，立即進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。

4. 擴(kuò)增反應(yīng)（擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)）

   使用熒光定量PCR儀，熒光基團(tuán)選擇FAM，淬滅基團(tuán)選擇TAMRA。

   按下列條件設(shè)置擴(kuò)增反應(yīng)：

PCR循環(huán)			熒光收集位點(diǎn)
95℃	10分鐘	1個(gè)循環(huán)	—
95℃	15秒	40個(gè)循環(huán)	—
60℃	30秒		※

6.基線和閾值設(shè)定

  基線調(diào)整取3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)，閾值線應(yīng)超過陰性對照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)

◆ 結(jié)果判定

檢測樣品Ct≥40，可報(bào)告樣品陰性，不含有沙門氏菌或含量低于檢測限；

檢測樣品Ct＜40，曲線呈“S”型擴(kuò)增曲線，可直接報(bào)告樣品陽性，含有沙門氏菌；

• NG反應(yīng)為平滑直線，PG反應(yīng)為“S”型擴(kuò)增曲線且Ct值＜30，此次檢測結(jié)果有效，否則無效。如重復(fù)檢測結(jié)果仍為無效，請與技術(shù)支持人員聯(lián)系。
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