溫和氣單胞菌核酸檢測試劑盒（一管式恒溫熒光法）使用說明書
溫和氣單胞菌核酸檢測試劑盒（一管式恒溫熒光法）
◆ 產(chǎn)品說明
動物疫病檢測系列基于獨特的恒溫熒光檢測技術(shù)，可針對食品、動物組織等樣品中病原的特異核酸片段進行擴增，通過實時擴增曲線判定結(jié)果。本產(chǎn)品用于溫和氣單胞菌的檢測，檢出限為103copies/μl基因組DNA
◆ 產(chǎn)品組成（96測試）
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012061LⅢ |
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試劑 |
含量 |
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A-AS-I |
22μL× 96管 |
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B-I |
90μL × 2支 |
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NG-I |
50μL × 3支 |
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PG-AS-I |
50μL × 2支 |
◆ 適用儀器
Dhelix-C、ESE Tube Scanner、Genie II、Deaou-308C等恒溫熒光檢測儀，ABI 7500，LightCycler480，CFX 96等熒光PCR儀。
◆ 自備耗材和儀器
①滅菌1.5mL或2.0mL離心管；②冰盒；③移液器（0.1-2.5μL，0.5-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套滅菌吸頭；④離心機；⑤渦旋混勻器；⑥金屬浴
◆ 注意事項
1．本試劑檢測靈敏度高。為了防止污染，實驗要分區(qū)操作。
1）第一區(qū)：樣本制備區(qū)。
2）第二區(qū)：模板添加區(qū)。
3）第三區(qū)：擴增及產(chǎn)物分析區(qū)。
★分區(qū)之間最好進行物理性隔離，避免人為因素造成的污染。
2．實驗過程中穿戴工作服和乳膠手套，不同區(qū)域獨立使用工具，需更換手套和實驗服。
3．嚴格按照操作步驟操作，試劑配制和加樣等步驟請嚴格按照說明書要求在冰盒上操作。
4．反應液中的成分對光敏感，應避光保存。試劑使用前要完全解凍，但應避免反復凍融，推薦使用前離心30秒。
5．反應結(jié)束后，擴增管請置于密封袋內(nèi)丟棄，當日清理，開蓋易造成氣溶膠污染，禁止開蓋。
6．不同批號試劑請勿混合使用，在有效期內(nèi)使用。
◆ 樣品處理
參照下述方法處理樣品。
(1)若對樣本不增菌直接進行檢測，則取患病動物的病灶組織做勻漿備用。
(2)若對樣本中細菌進行增菌檢測，則取待檢測樣品，以無菌操作取檢樣25 g（mL），胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）225mL，用旋轉(zhuǎn)刀片式均質(zhì)器以8000rpm/min均質(zhì)1 min，或者拍擊式均質(zhì)器拍擊2 min，制備成1:10的均勻稀釋液。如無均質(zhì)器，則將25g樣品放入無菌乳缽中磨碎，然后放在500 mL的滅菌容器內(nèi)，加225 mL 胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB），并充分振蕩后于28℃培養(yǎng)6h～16h。
詳細步驟請按照標準操作或查閱食安通軟件。
◆ 實驗操作
1. 模板制備（樣本制備區(qū)）
1.1不增菌直接檢測
請參照水生動物病害基因組DNA快速提取試劑盒說明書的提取步驟。
1.2 增菌后檢測
1）取增菌液1~2 mL，10000rpm離心5 min，棄上清液；
2）加入500 μL 無菌0.9% NaCl水溶液或醫(yī)用生理鹽水渦旋混勻，10000 rpm 離心5 min，盡量棄凈上清液，保留管底沉淀；
3）混勻提取液后，向管底沉淀中加入100 μLDNA提取液，劇烈渦旋混勻，100℃加熱10 min，加熱后迅速冷卻（置于-20℃冰箱）10 min；
4）10000 rpm離心2 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中低溫保存?zhèn)溆没颥F(xiàn)場完成檢測。
2．添加模板（模板添加區(qū)，放置于冰盒中進行）
取出所需測試數(shù)的已含有反應液的PCR管，將試劑完全解凍，解凍后打開管蓋向各管管底分別加入1μL B-I，蓋上管蓋離心1 min。打開管蓋分別向各管管壁上加入2μL模板，順序為NG-I、待測樣品模板、PG-AS-I。蓋好PCR管蓋后，離心3 min，立即進行PCR擴增反應。
3. 擴增反應（擴增及產(chǎn)物分析區(qū)）
①恒溫儀器63℃條件下反應60 min。
②若使用熒光定量PCR儀，則熒光基團選擇FAM，淬滅基團選擇None，將63℃ 15 s，63℃ 45 s作為一個循環(huán)，于63℃ 45 s處收集熒光信號，60個循環(huán)。
若使用其他儀器請參照儀器說明書進行設置。
◆ 結(jié)果判定
①恒溫儀器自動判定結(jié)果，若顯示“陽性”，則樣品中含有溫和氣單胞菌；若顯示“陰性”，則樣品中不含有溫和氣單胞菌或含量低于檢測限。如在50min~60min間出現(xiàn)曲線上揚而自動判讀結(jié)果為陰性，可能由于樣品含量較低導致，建議對樣品進行富集后復核。
②在熒光定量PCR儀上，根據(jù)有無“S”型擴增曲線判定結(jié)果。若有“S”型擴增曲線，則樣品中含有溫和氣單胞菌；若無“S”型擴增曲線，則樣品中不含有溫和氣單胞菌或含量低于檢測限。
- NG反應管結(jié)果顯示“陰性”，PG反應管結(jié)果顯示“陽性”，此次檢測結(jié)果有效，否則無效。如重復檢測結(jié)果仍為無效，請與技術(shù)支持人員聯(lián)系。
