Surfactin菌株產(chǎn)量的定向啟動(dòng)子改造技術(shù)應(yīng)用

     SrfA是surfactin合成的功能基因，是一個(gè)長達(dá)26.2 kb大小的基因簇，因此，通過過表達(dá)該基因來強(qiáng)化surfactin的合成途徑在技術(shù)上存在較大難度。該功能基因受到啟動(dòng)子PsrfA的調(diào)控，而啟動(dòng)子的強(qiáng)弱可以在一定程度上決定菌株的生產(chǎn)能力，因此，啟動(dòng)子替換被認(rèn)為是提高原始菌株產(chǎn)脂肽的合理手段。

      啟動(dòng)子改造促進(jìn)產(chǎn)量提升的典型成功案例來自于對天然高產(chǎn)菌株的改造結(jié)果。Sun等通過同源重組的方法將B. subtilis fmbR中的啟動(dòng)子PsrfA替換成一個(gè)來源于B. subtilis的強(qiáng)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Pspac，得到了重組菌株fmbR-1；在IPTG (300μmol/L)誘導(dǎo)下重組菌株fmbR-1的產(chǎn)量是野生型出發(fā)菌株的10倍，產(chǎn)量達(dá)到3.86g/L；在無IPTG添加條件下，fmbR-1的產(chǎn)量也可以高達(dá)5倍左右。除了替換一些天然強(qiáng)啟動(dòng)子外，還可以替換一些人工合成的啟動(dòng)子。清華大學(xué)于慧敏課題組在surfactin的啟動(dòng)子改造方面也獲得了顯著成果。Song等分析了surfactin高產(chǎn)野生菌株B. subtilis THY-7的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)該菌株控制surfactin合成的原始啟動(dòng)子PsfrA是一個(gè)弱啟動(dòng)子，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了菌株自身的一些強(qiáng)啟動(dòng)子(PgroE、PsacB、PsacP)；令人驚訝的是用強(qiáng)啟動(dòng)子PgroE替換原始啟動(dòng)子PsfrA后，重組菌株不能合成surfactin；隨后人工構(gòu)建了3個(gè)雜合型強(qiáng)啟動(dòng)子Pg1、Pg2和Pg3用于改造B. subtilis THY-7菌株。

     雜合型啟動(dòng)子Pg1融合了啟動(dòng)子PgroE的–35到–10序列和PsacB的RAT誘導(dǎo)元件序列，重組菌株THY-7/Pg1的產(chǎn)量達(dá)到了1.44g/L。雜合型啟動(dòng)子Pg2是在Pg1的基礎(chǔ)上，在PgroE的–35到–10序列中間融合了一段lacO操縱子序列，重組菌株THY-7/Pg2的產(chǎn)量為5.98g/L。雜合型啟動(dòng)子Pg3是根據(jù)枯草芽胞桿菌的sigma因子70(σA)的–35到–10的保守序列以及點(diǎn)突變Pg2的2個(gè)堿基的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)而來的，最終重組菌株THY-7/Pg3在5L發(fā)酵罐上(具有泡沫回收裝置)發(fā)酵32h的產(chǎn)量達(dá)到了9.74g/L，表明改造后的菌株具有高產(chǎn)、高生產(chǎn)速率等優(yōu)良性狀。該重組菌株的surfactin產(chǎn)量也是目前報(bào)道的最高產(chǎn)量。

     但是，在模式菌株或其他菌株中也存在啟動(dòng)子改造的失敗案例。Coutte等用組成型啟動(dòng)子PrepU替換了B. subtilis 168衍生菌株BBG111的PsrfA后，得到突變菌株BBG113的surfactin產(chǎn)量卻有所下降。隨后Wilenbacher等的研究發(fā)現(xiàn)，用一個(gè)強(qiáng)的組成型啟動(dòng)子Pveg分別替換產(chǎn)surfactin能力弱的菌株3A3B和產(chǎn)surfactin能力強(qiáng)的DSM 10T的原始啟動(dòng)子PsrfA，產(chǎn)生重組菌JWSurf2和JWSurf3；結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組菌JWSurf2的surfactin產(chǎn)量高于原始菌3A3B，而JWSurf3的產(chǎn)量卻遠(yuǎn)低于原始菌DSM 10T。

      由此我們可知，通過定向改造產(chǎn)surfatin菌株的啟動(dòng)子PsrfA并不都會(huì)導(dǎo)致surfactin產(chǎn)量的提高，這可能與菌株自身產(chǎn)surfactin能力的強(qiáng)弱以及菌株特性有關(guān)。對野生型surfactin生產(chǎn)菌株進(jìn)行啟動(dòng)子改造前，有必要對菌株的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，有針對性地改造或構(gòu)建適合該菌株的強(qiáng)啟動(dòng)子或雜合啟動(dòng)子，有助于提高成功率。同時(shí)，也要考慮到野生芽胞桿菌的遺傳操作系統(tǒng)存在很多不確定性，大大增加了分子改造的難度；選擇和構(gòu)建合適的遺傳操作方法是成功的基礎(chǔ)。