細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的支原體污染的來(lái)源與控制方法

Mycoplasma國(guó)內(nèi)主要有三種譯名，醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)譯為“支原體”（分枝原體，枝原體，類(lèi)菌質(zhì)體），動(dòng)物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)譯為“霉形體”或“支原體”，臺(tái)灣、香港則譯為微漿菌。

支原體是目前已知一類(lèi)能在無(wú)生命培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖的最小的原核細(xì)胞型微生物。自然界分布廣泛，種類(lèi)多，有80余種，分為兩個(gè)屬：一為支原體屬（Mycoplasma），有幾十個(gè)種；另一為脲原體屬（Ureaplasma），僅有一種。與人類(lèi)感染有關(guān)的主要是肺炎支原體和解脲脲原體。

支原體無(wú)細(xì)胞壁，多呈不規(guī)則球狀、長(zhǎng)絲狀，可分枝，營(yíng)寄生共生或腐生。一般侵害對(duì)象為動(dòng)植物，可造成多種疾病。

細(xì)胞培養(yǎng)（特別是傳代細(xì)胞）被支原體污染是個(gè)世界性問(wèn)題。國(guó)內(nèi)外研究表明，95%以上是以下四種支原體：口腔支原體（M.orale）、精氨酸支原體（M.arginini）、豬鼻支原體（M.hyorhinis）和菜氏無(wú)膽甾原體（A.laidlawii），為牛源性。國(guó)外調(diào)查證明，大約有二十多種支原體能污染細(xì)胞，有的細(xì)胞株可以同時(shí)污染兩種以上的支原體。

支原體污染的來(lái)源包括工作環(huán)境的污染、操作者本身的污染（某些支原體在人體是正常菌群）、培養(yǎng)基的污染、被污染細(xì)胞造成的交叉污染、實(shí)驗(yàn)器材的污染、制備細(xì)胞的原始組織或器官的污染，等等。
體外生長(zhǎng)的細(xì)胞對(duì)微生物及一些有害有毒物質(zhì)沒(méi)有抵抗能力，因此培養(yǎng)基應(yīng)達(dá)到無(wú)化學(xué)物質(zhì)污染、無(wú)微生物污染（如細(xì)菌、真菌、支原體、病毒等）、無(wú)其他對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷作用的生物活性物質(zhì)污染（如抗體、補(bǔ)體）。對(duì)于天然培養(yǎng)基，污染主要來(lái)源于取材過(guò)程及生物材料本身，應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格選材，嚴(yán)格操作。對(duì)于合成培養(yǎng)基，污染主要來(lái)源于配制過(guò)程，配制所用的水，器皿應(yīng)十分潔凈，配制后應(yīng)嚴(yán)格過(guò)濾除菌。

由于體外培養(yǎng)細(xì)胞自身沒(méi)有抵抗污染的能力，而且培養(yǎng)基中的抗生素抗污染能力有限，因而培養(yǎng)細(xì)胞一旦發(fā)生污染多數(shù)將無(wú)法挽回。支原體污染后，因?yàn)樗鼈儾粫?huì)使細(xì)胞死亡可以與細(xì)胞長(zhǎng)期共存，培養(yǎng)基一般不發(fā)生渾濁，細(xì)胞無(wú)明顯變化，外觀上給人以正常感覺(jué)，實(shí)則細(xì)胞受到多方面潛在影響，如引起細(xì)胞變形，影響DNA合成，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)等。

組織細(xì)胞培養(yǎng)工作中，可以從以下幾方面來(lái)預(yù)防支原體的污染：控制環(huán)境污染；嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)操作；細(xì)胞培養(yǎng)基和器材要保證無(wú)菌；在細(xì)胞培養(yǎng)基沖加入適量的抗生素。

抗生素主要用于消毒培養(yǎng)液，是培養(yǎng)過(guò)程中預(yù)防微生物污染的重要手段，也是微生物污染不嚴(yán)重時(shí)的“急救”方法。不同抗生素殺滅微生物不同，應(yīng)根據(jù)需要選擇。

在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中如果發(fā)現(xiàn)破碎的細(xì)胞甚多，培養(yǎng)細(xì)胞需要頻繁改善營(yíng)養(yǎng)環(huán)境才能支持長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)該懷疑支原體污染。支原體污染難以觀察特殊的外觀變化，培養(yǎng)液也不渾濁。

從2013年開(kāi)始，《Nature》期刊已正式要求涉及細(xì)胞培養(yǎng)的投稿文章，要求必須進(jìn)行支原體檢測(cè)，截止目前，大量的SCI期刊都跟進(jìn)這項(xiàng)要求。為了提高動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生物制品的質(zhì)量和安全性，中華人民共和國(guó)藥典規(guī)定主細(xì)胞庫(kù)、工作細(xì)胞庫(kù)、病毒種子批、對(duì)照細(xì)胞以及臨床治療用細(xì)胞應(yīng)進(jìn)行支原體檢測(cè)。美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)規(guī)定，應(yīng)該用合適的方法檢測(cè)細(xì)胞的支原體污染狀況。歐洲藥典規(guī)定對(duì)細(xì)胞治療產(chǎn)品需要進(jìn)行嚴(yán)格的支原體檢測(cè)。以上這些要求和規(guī)定，再加上支原體的特性和污染的后果都指向一點(diǎn)——支原體分子檢測(cè)成為細(xì)胞培養(yǎng)必不可少的環(huán)節(jié)。先達(dá)基因研發(fā)了一種細(xì)胞污染支原體檢測(cè)試劑盒，每次檢測(cè)只需半個(gè)小時(shí)，減少了很多工作量其原理是基于公司自主開(kāi)發(fā)的實(shí)時(shí)熒光恒溫核酸檢測(cè)技術(shù)（ERA），可以在恒定的低溫下（25℃-42℃）對(duì)痕量的支原體種內(nèi)保守性DNA片段進(jìn)行特異性的擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)可以在20min內(nèi)完成，該試劑盒檢測(cè)范圍涵蓋130種支原體。

支原體污染細(xì)胞后，特別是重要的細(xì)胞株，有必要清除支原體，常用方法有：抗生素處理、抗血清處理、抗生素加抗血清和補(bǔ)體聯(lián)合處理。要注意的是：支原體沒(méi)有細(xì)胞壁，故作用于細(xì)胞壁生物合成的抗生素，如內(nèi)酰胺類(lèi)、萬(wàn)古霉素等是不敏感的；對(duì)多粘菌素、利福平、磺胺藥物普遍耐藥。對(duì)支原體最有抑制活性抗生素是四環(huán)素類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)等，氨基糖苷類(lèi)、氯霉素對(duì)支原體有較小的抑制作用。必要時(shí)更換所有培養(yǎng)用物。通常，濾過(guò)除菌的方法對(duì)支原體是沒(méi)有作用的。

由于一些微生物，如支原體，病毒等能通過(guò)濾膜，所以過(guò)濾藥品仍潛在被外源微生物污染的危險(xiǎn)，近年來(lái)，6Co輻射滅菌技術(shù)在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，由于輻射滅菌能夠徹底殺滅所有微生物。有試驗(yàn)證實(shí)以2Mrad輻射處理的各培養(yǎng)基樣品達(dá)到了無(wú)菌要求，經(jīng)多批培養(yǎng)試驗(yàn)，輻射滅菌安全可靠；輻射滅菌的培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)性能不低于過(guò)濾組，證明輻射滅菌對(duì)培養(yǎng)基性能無(wú)不良影響；對(duì)血清的輻射滅菌試驗(yàn)效果也表明60COγ射線不影響培養(yǎng)效果。把干粉培養(yǎng)基經(jīng)無(wú)菌操做定量分裝于滅菌容器內(nèi)，輻射后以干粉原型貯藏，不但培養(yǎng)基的純凈性得到保障，而且營(yíng)養(yǎng)性能較過(guò)濾后以水溶液形式保存更穩(wěn)定，對(duì)谷氨酰胺等這類(lèi)水溶液不穩(wěn)定者特別合適。