無(wú)縫克隆-讓載體構(gòu)建如此簡(jiǎn)單

基因克隆或分子克隆，是應(yīng)用酶學(xué)方法在體外將不同來(lái)源的DNA分子重新組裝成雜合分子，并使之在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增，形成大量子代DNA分子的過(guò)程。

基因克隆方法經(jīng)過(guò)幾十年的發(fā)展，從傳統(tǒng)的DNA連接酶介導(dǎo)的平粘末端克隆及TA克隆技術(shù)，到基于拓?fù)洚悩?gòu)酶的TOPO克隆技術(shù)，再到基于DNA重組酶的Gateway重組和無(wú)縫克隆技術(shù)。相比之下，無(wú)縫克隆操作更加簡(jiǎn)單，靈活性更強(qiáng)，同時(shí)幾乎不受序列的限制，一次可定向組裝多個(gè)片段的dsDNA。

無(wú)縫克隆的原理
與傳統(tǒng)的雙酶切克隆類似，無(wú)縫克隆同樣需要依賴于dsDNA的黏性末端進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)，并利用DNA連接酶催化形成磷酸二酯鍵修復(fù)缺口。但是，無(wú)縫克隆并不使用“內(nèi)切酶”來(lái)制造黏性末端，而是通過(guò)“外切酶”T5核酸外切酶來(lái)產(chǎn)生的，它能沿著5’→3’方向，降解dsDNA，從而產(chǎn)生黏性末端。我們可以通過(guò)PCR的方法，在外源拼接片段的兩端加上線性化載體的序列，在T5外切酶作用下，就能產(chǎn)生幾乎一致的黏性末端。相同的黏性末端互補(bǔ)配對(duì)之后，借助DNA聚合酶進(jìn)行修復(fù)添加缺失的堿基。最后一步借助Taq DNA連接酶，催化形成磷酸二酯鍵，將所有缺口補(bǔ)齊。
 

無(wú)縫克隆的優(yōu)勢(shì)
1.不受片段序列的限制、實(shí)現(xiàn)任意組裝。
傳統(tǒng)的酶切克隆，會(huì)受到酶切位點(diǎn)的限制。而無(wú)縫克隆不依賴于限制性內(nèi)切酶，僅需通過(guò)引物制作同源臂，只要一個(gè)試劑盒就可解決所有克隆實(shí)驗(yàn)。

2.同時(shí)無(wú)縫地拼接多個(gè)片段。
傳統(tǒng)的酶切克隆，由于酶切位點(diǎn)限制，能組裝的片段數(shù)量有限且在片段與片段之間產(chǎn)生“縫隙”。多片段拼接操作復(fù)雜，效率也較低。而無(wú)縫克隆可通過(guò)一步反應(yīng)輕松拼接4-5個(gè)片段，最高可達(dá)10個(gè)。

3.節(jié)省時(shí)間，操作簡(jiǎn)便。
傳統(tǒng)的酶切克隆，首先需要進(jìn)行PCR，膠回收，然后酶切載體和外源片段，再純化、連接、轉(zhuǎn)化。如果需要進(jìn)行多片段組裝，還要花費(fèi)更多時(shí)間。而無(wú)縫克隆僅需PCR和純化或膠回收，隨后即可直接進(jìn)行一步多片段拼接。

無(wú)縫克隆實(shí)驗(yàn)流程及設(shè)計(jì)方法
麥伯生物的Magic MultiS One Step Cloning kit 產(chǎn)品在30分鐘內(nèi)可以將一個(gè)或多個(gè)PCR擴(kuò)增片段（平端）克隆插入任意載體的任意位置，室溫孵育即可完成片段的連接，高效，準(zhǔn)確，克隆陽(yáng)性率可達(dá)95%以上。實(shí)驗(yàn)流程如下圖：
 

引物設(shè)計(jì)原則：通過(guò)在引物5’端引入線性化克隆載體末端同源序列，使擴(kuò)增產(chǎn)物之間以及擴(kuò)增產(chǎn)物與線性化克隆載體之間都具有能夠相互同源重組的完全一致的序列 (15 bp～25 bp)。
 

麥伯應(yīng)用實(shí)例

1. 使用麥伯生物的Magic MultiS One Step Cloning kit進(jìn)行單片段及多片段重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后，平板上均可產(chǎn)生較多單克隆，無(wú)插入片段的陰性對(duì)照版上幾乎無(wú)克隆產(chǎn)生。
 

2. 單片段轉(zhuǎn)化板挑取20個(gè)單克隆進(jìn)行菌落PCR，克隆陽(yáng)性率達(dá)95%以上。
 

3.  4片段重組轉(zhuǎn)化板挑取15個(gè)單克隆進(jìn)行菌落PCR，克隆陽(yáng)性率達(dá)85%以上。