多肽FRET熒光標記技術

熒光標記所依賴的化合物稱為熒光物質(zhì)。熒光物質(zhì)是指具有共軛雙鍵體系化學結構的化合物，受到紫外光或藍紫光照射時，可激發(fā)成為激發(fā)態(tài)，當從激發(fā)態(tài)恢復基態(tài)時，發(fā)出熒光。熒光標記技術指利用熒光物質(zhì)共價結合或物理吸附在所要研究分子的某個基團上，利用它的熒光特性來提供被研究對象的信息。熒光標記的無放射物污染，操作簡便等優(yōu)點，使得熒光標記物在許多研究領域的應用日趨廣泛。人們利用熒光標記的多肽來檢測目標蛋白的活性，并將其發(fā)展的高通量活性篩選方法應用于疾病治療靶點蛋白的藥物篩選和藥物開發(fā)（例如，各種激酶、磷酸酶、肽酶等）。肽谷生物經(jīng)過長期開發(fā)，能夠提供技術成熟的各種熒光標記多肽。

熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET)是一種非輻射能量躍遷，通過分子間的電偶極相互作用，將供體激發(fā)態(tài)能量轉(zhuǎn)移到受體激發(fā)態(tài)的過程。此過程沒有光子的參與，所以是非輻射的。該分析方法具有快速、敏感和簡單等優(yōu)點。

用于FRET試驗的染料是可以相同的。但在大多數(shù)應用中其實是使用不同的染料。例如，一個供體基團（EDANS）和接受基因（DABCYL）勻被連接到一HIV蛋白酶的天然底物上，當該底物未被切斷時，DABCYL可淬滅EDANS，從而檢測不到熒光。當該底物被HIV-1蛋白酶切斷后，EDANS不再被DABCYL淬滅，隨即可檢測到EDANS熒光。蛋白酶抑制劑的有效性可憑借EDANS熒光強度的變化進行監(jiān)測。

FRET肽是研究肽酶特異性的便利工具，由于其反應過程可被連續(xù)監(jiān)測，為酶活性的檢測提供了一個便捷的方法。供體/受體對的肽鍵水解后產(chǎn)生的熒光可衡量納摩爾級濃度的酶活性。當FRET肽是完整的，表現(xiàn)出的是內(nèi)部的熒光猝滅，但當供體/受體對的任何肽鍵斷裂就會釋放出熒光，此熒光可被連續(xù)檢測，從而可對酶的活性進行定量分析。FRET 肽可作為各類酶研究的合適底物，比如：肽酶、蛋白酶、激酶、磷酸酶的動力特征和功能特征；對新的蛋白水解酶的篩選和檢測；對多肽折疊的構象研究等。

常用FRET的標準染料組合

Fluorescein and Dabcyl:	FAM/Lys(Dabcyl)
Fluorescein and Tamra:	FAM/TAMRA
Methoxy-coumarin-acetic-acid(MCA) and 2,4-Dinitrophenyl(DNP):	MCA/Lys(Dnp).
Ortho-aminobenzoic acid (Abz) and 2,4-dinitrophenyl (Dnp) Abz/Tyr (NO2) or N-(2,4-dinitrophenyl)ethylenediamine (EDDnp):	Abz/Tyr (NO2) Abz/EDDnp
Dabcyl and Glu(EDANS)：	Dabcyl/Glu(EDANS)

FRET共振能量轉(zhuǎn)移引發(fā)熒光猝滅的激發(fā)與發(fā)射波

猝滅劑	熒光團	激發(fā)波(nm)	發(fā)射波(nm)
Dabcyl	Edans	336	490
Dansyl	Trp	336	350
DNP	Trp	328	350
DNP	MCA	328	393
DNP	Abz	328	420
Tyr (NO2)	Abz	320	420

常規(guī)RET供體(Donor)-接受(Aceptor)對的福斯特臨界距離(Forster Critical Distance)

供體(Donor)	接受(Aceptor)	福斯特臨界距離(nm)
Tryptophan	Dansyl	2.1
IAEDANS (1)	DDPM (2)	2.5-2.9
BFP	DsRFP	3.1-3.3
Dansyl	FITC	3.3-4.1
Dansyl	Octadecylrhodamine	4.3
CFP	GFP	4.7-4.9
CF (3)	Texas Red	5.1
Fluorescein	Tetramethylrhodamine	4.9-5.5
Cy3	Cy5	5.0
GFP	YFP	5.5-5.7
BODIPY FL (4)	BODIPY FL (4)	5.7
Rhodamine 6G	Malachite Green	6.1
FITC	Eosin Thiosemicarbazide	6.1-6.4
B-Phycoerythrin	Cy5	7.2
Cy5	Cy5.5	>8.0

      (1): 5-(2-iodoacetylaminoethyl)aminonaphthalene-1-sulfonic acid
      (2): N-(4-dimethylamino-3,5-dinitrophenyl) maleimide
      (3): carboxyfluorescein succinimidyl ester
      (4): 4,4-difluoro-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene