多肽磷酸化修飾及檢測方法

磷酸化影響著細(xì)胞生命的方方面面。在細(xì)胞中，大概有1/3的的蛋白質(zhì)被認(rèn)為是通過磷酸化修飾的。蛋白質(zhì)的磷酸化修飾與多種生物學(xué)過程密切相關(guān)，如DNA損傷修復(fù)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、信號傳導(dǎo)、細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)等。磷酸化蛋白質(zhì)及多肽的研究可以幫助人們闡述上述過程的機理，進一步認(rèn)識生命活動的本質(zhì)。肽谷生物依據(jù)自身原料優(yōu)勢和技術(shù)優(yōu)勢，可以合成含有磷酸化絲氨酸(pSer)、磷酸化蘇氨酸(pThr)、磷酸化酪氨酸(pTyr)的多肽，并可以提供含有一個，兩個，三個，四個，五個磷酸化位點修飾的高質(zhì)量多肽。

1. 多肽磷酸化標(biāo)記簡介
磷酸化多肽主要指肽鏈中的Ser、Tyr和Thr殘基的側(cè)鏈羥基被修飾成酸式磷酸酯多肽。磷酸化多肽是研究蛋白質(zhì)磷酸化過程的必不可少的工具，因此研究蛋白質(zhì)及多肽的磷酸化反應(yīng)并確定成熟簡便的合成路線就變得非常重要。目前，多肽的磷酸化修飾方法主要有兩種：
      （1）將適當(dāng)保護的磷酸化氨基酸直接引入到多肽序列中；
      （2）多肽序列在樹脂上合成完后，再對其中的Ser、Tyr或Thr的側(cè)鏈羥基進行磷酸化。

1）將適當(dāng)保護的磷酸化氨基酸直接引入到多肽序列中：
即事先將需要磷酸化的氨基酸（Thr,Ser或Tyr）磷酸化并適當(dāng)保護，然后按照正常SPPS合成流程將磷酸化單體縮合到多肽指定位點。這種方法操作簡便，已經(jīng)成為多肽單位點磷酸化修飾的主要方法。
 
2）多肽序列在樹脂上合成完后，再對其中的Ser、Tyr或Thr的側(cè)鏈羥基進行磷酸化：
采用將磷酸化單體縮合到多肽中的方法進行磷酸化修飾時，磷酸化的氨基酸由于側(cè)鏈修飾的較大基團產(chǎn)生的位阻而導(dǎo)致難以與肽鏈縮合，并且之后的氨基酸引入都會比較困難，尤其在含有多個磷酸化位點修飾時，合成將變得異常困難，并且最終產(chǎn)物成分復(fù)雜，難以分離，產(chǎn)率極低。因此，當(dāng)肽鏈中多個位點進行磷酸化時，可以考慮采用將多肽序列在樹脂上合成完后，再對其中的Ser、Tyr或Thr的側(cè)鏈羥基進行磷酸化：其合成過程主要就是在多肽合成結(jié)束之后，選擇性的脫去要標(biāo)記氨基酸的側(cè)鏈保護基，對于Tyr，Thr可以直接使用側(cè)鏈不保護的氨基酸進行反應(yīng)。側(cè)鏈保護基在1%TFA/DCM條件下可以定量的脫除。采用這種方法時，可以采用雙芐基亞磷酰胺，四氮唑生成亞磷酰胺四唑活性中間體，連接到羥基上，然后在過氧酸條件下氧化生成磷�；�，完成反應(yīng)。

2. 檢測蛋白質(zhì)磷酸化的方法簡介
激酶活性檢測
在體外，激酶活性的檢測是將經(jīng)免疫沉淀法獲得的蛋白激酶與某一底物在ATP環(huán)境下共同孵育，然后再檢測。磷酸化底物的測量可以通過報告系統(tǒng)如比色法、放射性或熒光檢測而得。

磷酸化特定性抗體的開發(fā)
磷酸化抗體已被許多研究者使用。首先合成磷酸化多肽，即圍繞靶蛋白磷酸化位點的氨基酸序列，接著共軛偶聯(lián)至血藍(lán)蛋白(KLH)上進行免疫。免疫血清將流經(jīng)多肽親和層析柱， 從而得到一個非常特異的免疫制劑。檢測的成功與否取決于抗體對靶磷酸化蛋白的特異性和親和力。

免疫印跡（Western Blot）
許多磷酸化抗體是十分敏感的，可以很容易地檢測到常規(guī)樣品中的磷酸化蛋白�；瘜W(xué)發(fā)光和比色法都是較常見的檢測方法，蛋白Markers通常用來為蛋白質(zhì)量提供標(biāo)準(zhǔn)。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)
ELISAs提供一種間接測量激酶活性的方法，其比WB更容易定量。磷酸化特異的ELISA技術(shù)可以很輕易地通過使用一個校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)來量化結(jié)果。通過雙抗體夾心方法，應(yīng)用兩個靶蛋白的特異性抗體可使檢測呈現(xiàn)高特異性。此外,基于微孔板的ELISAs檢測，更是具有高通量、 微量和對低豐度蛋白檢測的特點。

細(xì)胞ELISA（Cell-Based ELISA）
通過分析完整的細(xì)胞中磷酸化蛋白，可更準(zhǔn)確地反應(yīng)特性的信號網(wǎng)絡(luò)狀態(tài)。一般磷酸化抗體多通過熒光或比色法來檢測磷酸化狀態(tài)。

流式細(xì)胞術(shù)(FCM)和ICC/IHC
流式細(xì)胞術(shù)因其快速、定量、單細(xì)胞分析等特點而非常具有優(yōu)勢。細(xì)胞被誘導(dǎo)后，通過甲醛或多聚甲醛將其與磷酸化蛋白交聯(lián)固定，然后分析。固定的細(xì)胞需經(jīng)通透處理，以便磷酸化抗體的進入。

質(zhì)譜分析（Mass Spectrometry）
質(zhì)譜(MS)技術(shù)是一項用于識別磷酸化蛋白、磷酸化多肽和磷酸化殘基序列的便利工具。利 用MS卓越的靈敏度和分辨率，可識別某一單個蛋白質(zhì)或多肽。但來自磷酸化多肽的信號通常較弱，因而新的技術(shù)正在被研發(fā)以增強MS信號。這些策略包括固化金屬親和層析，磷酸化抗體的豐富，化學(xué)修飾方法和用生物素部份置換磷酸基團。

xMAP(flexible Multi-Analyte Profiling) 技術(shù)
Multi-Analyte profiling技術(shù)涉及磷酸化抗體的應(yīng)用和基于微孔板及膜的檢測方式。這些檢測技術(shù)可提供大量的數(shù)據(jù)，卻只需極少量的樣本。然而，這些檢測技術(shù)并不比傳統(tǒng)的檢測方法敏感，原因在于潛在的抗體交叉反應(yīng)。