常用多肽修飾方法及過程綜述

多肽是一種由兩個或多個氨基酸通過肽鍵（酰胺鍵）連接而形成的化合物。多肽在調(diào)節(jié)機體各系統(tǒng)、器官、組織和細(xì)胞的功能活動以及在生命活動中發(fā)揮重要作用，并且常被應(yīng)用于功能分析、抗體研究、藥物研發(fā)等領(lǐng)域。而通過對多肽進(jìn)行修飾進(jìn)而改變多肽的理化性質(zhì)也是多肽研究中一種常用的手段。多肽修飾種類繁多，從修飾位點不同則可分為N端修飾、C端修飾、側(cè)鏈修飾、氨基酸修飾、骨架修飾等（圖1）。作為一種改變肽鏈主鏈結(jié)構(gòu)或側(cè)鏈基團(tuán)的重要手段，多肽修飾可有效改變肽類化合物的理化性質(zhì)、增加水溶性、改變其生物分布狀況、延長體內(nèi)作用時間、降低毒副作用、消除免疫原性等。今天我們來介紹幾種最主要的多肽修飾及特點。
  1、環(huán)化
在自然界中，許多具有生物活性的多肽都是環(huán)狀多肽，因此環(huán)肽在現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)中有主多應(yīng)用。環(huán)肽相較于線性肽，具有更好的剛性，對消化系統(tǒng)具有極強的抵抗力，因此可以在消化道中存貨，并且對靶受體表現(xiàn)出更強的親和力。環(huán)狀多肽通常都是通過環(huán)化來實現(xiàn)的，根據(jù)環(huán)化方式可以分為側(cè)鏈-側(cè)鏈?zhǔn)�、終端-側(cè)鏈?zhǔn)�、終端-終端式（頭尾相連式）。
 
（1）側(cè)鏈-側(cè)鏈?zhǔn)剑╯ide chain-to-side chain）
通過半胱氨酸殘基間的二硫橋接是一種最常見的多肽成環(huán)方式，而這種方式就屬于側(cè)鏈-側(cè)鏈?zhǔn)江h(huán)化，引入這種環(huán)化的方法是通過一對半胱氨酸殘基脫保護(hù)然后氧化構(gòu)成二硫鍵。通過選擇性地移除巰基保護(hù)基可以實現(xiàn)多環(huán)的合成。環(huán)化既可以在解離后的溶劑里完成，也可以在解離前的樹脂上完成。由于樹脂上的多肽不易形成可環(huán)化的構(gòu)象，因此在樹脂上環(huán)化可能要比在溶劑中環(huán)化低效。第二種側(cè)鏈-側(cè)鏈?zhǔn)江h(huán)化類型是在門冬氨酸或谷氨酸殘基與基礎(chǔ)氨基酸之間形成酰胺結(jié)構(gòu)，它要求多肽無論是在樹脂上還是解離后，側(cè)鏈保護(hù)基都必須能夠選擇性移除。第三種側(cè)鏈-側(cè)鏈?zhǔn)江h(huán)化是通過酪氨酸或?qū)αu基苯甘氨酸形成聯(lián)苯醚，但是制備這些化合物需要獨特的反應(yīng)條件，因此不常用于常規(guī)多肽的合成。

（2）終端-側(cè)鏈?zhǔn)剑╰erminal-to-side chain）
終端-側(cè)鏈?zhǔn)江h(huán)化通常涉及C末端與賴氨酸或鳥氨酸側(cè)鏈的氨基，或者N末端與門冬氨酸或谷氨酸側(cè)鏈形成酰胺鍵而成環(huán)。還有一些多肽環(huán)化是通過末端C與絲氨酸或蘇氨酸側(cè)鏈形成醚鍵而構(gòu)成。

（3）終端-終端式或頭尾相連式（head-to-tail）
終端-終端式或頭尾相連式是通過多肽N端氨基和C端羧基通過形成酰胺化而形成，鏈狀多肽可以在溶劑中環(huán)化或者固定在樹脂上通過側(cè)鏈環(huán)化。在溶劑中環(huán)化應(yīng)該用低濃度的多肽以避免多肽的低聚反應(yīng)。頭尾相連式合成環(huán)狀多肽的產(chǎn)率取決于鏈狀多肽的序列。因此，在大規(guī)模制備環(huán)狀多肽前，首先應(yīng)該創(chuàng)建可能的鏈狀先導(dǎo)多肽庫，然后進(jìn)行環(huán)化以尋找能達(dá)到最佳結(jié)果的序列。

2、糖基化
我們最常見的糖肽如萬古霉素和替考拉寧，是治療耐藥細(xì)菌感染的重要抗生素，其他糖肽常被用于刺激免疫系統(tǒng)。另外，由于很多微生物抗原是糖基化的，因此研究糖肽對提高感染的治療效果具有重要意義。另一方面，有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)表現(xiàn)出異常的糖基化，這使得糖肽在癌癥和腫瘤免疫防御研究中也發(fā)揮著重要作用。糖肽的制備一般利用Fmoc/t-Bu方法。糖基化殘基，比如蘇氨酸和絲氨酸常通過五氟苯酚酯活化的Fmoc保護(hù)糖基化氨基酸引入到多肽中。

3、磷酸化
在人類細(xì)胞中，超過30％的蛋白質(zhì)被磷酸化。磷酸化，尤其是可逆磷酸化，在控制許多細(xì)胞過程中起重要作用，如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)、細(xì)胞周期和細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)以及細(xì)胞凋亡。
磷酸化可以在各種氨基酸殘基上觀察到，但最常見的磷酸化目標(biāo)是絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基。磷酸酪氨酸、磷酸蘇氨酸和磷酸絲氨酸衍生物既可在合成中引入到多肽也可在多肽合成以后形成。使用可選擇性移除保護(hù)基團(tuán)的絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基可以實現(xiàn)選擇性磷酸化。一些磷�；�試劑也可通過后修飾在多肽中引入磷酸基團(tuán)。最近，也有學(xué)者使用化學(xué)選擇性的Staudinger-亞磷酸酯反應(yīng)實現(xiàn)了賴氨酸的位點特異性磷酸化的案例。
 
4、N-甲基化
N-甲基化通常被用來引入到多肽合成中以阻止氫鍵的形成，進(jìn)而使得多肽更加耐受生物降解和清除，最初出現(xiàn)在天然多肽中。利用N-甲基化的氨基酸衍生物（如Fmoc-N-Me-Val-OH，F(xiàn)moc-N-Me-Trp(Boc)-OH等）合成多肽是最主要的方法，另外也可利用N-(2-硝基苯磺酰氯)多肽-樹脂中間體與甲醇進(jìn)行Mitsunobu反應(yīng)，該方法已被用于制備含有N-甲基化氨基酸的環(huán)狀多肽庫。

5、豆蔻�；�和棕櫚酰化
通過多肽N末端脂肪酸�；�可以讓多肽或蛋白質(zhì)與細(xì)胞膜結(jié)合。N末端上豆蔻�；�的多肽可以使Src家族的蛋白激酶和逆轉(zhuǎn)錄酶Gaq蛋白靶向結(jié)合細(xì)胞膜。利用標(biāo)準(zhǔn)的酰胺縮合反應(yīng)即可將豆蔻酸連接到樹脂-多肽的N末端，生成的脂肽可在標(biāo)準(zhǔn)條件下解離并通過RP-HPLC純化。

6、生物素化
生物素可以與親和素或者鏈霉親和素有力結(jié)合，結(jié)合強度甚至接近共價鍵。生物素標(biāo)記的肽通常用于免疫測定，組織細(xì)胞化學(xué)和基于熒光的流式細(xì)胞術(shù)。標(biāo)記的抗生物素抗體也可以用來結(jié)合生物素化多肽。生物素標(biāo)記常連接在賴氨酸側(cè)鏈或者N末端。通常在多肽和生物素之間使用6-氨基己酸作為紐帶，紐帶能夠靈活結(jié)合底物，并且在有空間位阻的情況下能結(jié)合地更好。

7、熒光標(biāo)記
人們利用利用熒光標(biāo)記的多肽來檢測目標(biāo)蛋白的活性，并將其發(fā)展的高通量活性篩選方法應(yīng)用于疾病治療靶點蛋白的藥物篩選和藥物開發(fā)（例如，各種激酶、磷酸酶、肽酶等）。常用的熒光劑有FITC, FAM, TAMRA, CY3, CY5, Rhodamine等。色氨酸（Trp）也帶有熒光，因此可以被用于內(nèi)在標(biāo)記。色氨酸的發(fā)射光譜取決于外圍環(huán)境，隨著溶劑極性降低而降低，這種性質(zhì)對于檢測多肽結(jié)構(gòu)和受體結(jié)合很有用處。色氨酸熒光可以被質(zhì)子化的門冬氨酸和谷氨酸淬滅，這可能會限制其使用。丹磺酰氯基團(tuán)（Dansyl）與氨基結(jié)合時具有高度熒光，也常被用于氨基酸或蛋白質(zhì)的熒光標(biāo)記。
熒光共振能量轉(zhuǎn)換（FRET）對酶的研究十分有用，應(yīng)用FRET時，底物多肽常含有一個熒光標(biāo)記基團(tuán)和一個熒光淬滅基團(tuán)。標(biāo)記的熒光基團(tuán)會被淬滅劑通過非光子能量傳遞淬滅。當(dāng)多肽從所研究的酶上解離下來，標(biāo)記基團(tuán)就會發(fā)射熒光。

8、聚乙二醇（PEG）修飾
PEG修飾可用于改善蛋白水解穩(wěn)定性、生物分布和肽的溶解度。在多肽上引入PEG鏈可以改善它們的藥理性質(zhì)，也可以抑制多肽被蛋白水解酶水解。PEG多肽比普通多肽更容易通過腎小球毛細(xì)血管截面，大大減少腎清除率。由于PEG多肽在體內(nèi)的有效半衰期延長，因此使用更低劑量、更低頻度的多肽藥物便可以維持正常治療水平。但PEG修飾也存在負(fù)效應(yīng)。大量PEG在阻止酶降解多肽的同時也會減少多肽與目標(biāo)受體的結(jié)合。但PEG多肽的低親和力通常被其更長的藥動學(xué)半衰期抵消，通過在體內(nèi)存在更久，PEG多肽有更大可能性被目標(biāo)組織吸收。因此，PEG聚合物的規(guī)格應(yīng)該針對最佳結(jié)果進(jìn)行最優(yōu)化設(shè)計。另一方面，由于腎清除率降低，PEG多肽會在肝臟累積造成大分子綜合征。因此，當(dāng)多肽用于藥物測試時需要更加謹(jǐn)慎地設(shè)計PEG修飾。

PEG修飾劑常見的修飾基團(tuán)大致可總結(jié)如下：氨基（-Amine）-NH2，氨甲基-CH2-NH2，羥基-OH，羧基-COOH，巰基（-Thiol）-SH，馬來酰亞胺-MAL，琥珀酰亞胺碳酸酯-SC，琥珀酰亞胺乙酸酯-SCM，琥珀酰亞胺丙酸酯-SPA，N-羥基琥珀酰亞胺-NHS，丙酸基-CH2CH2COOH，醛基-CHO（如丙醛-ALD，丁醛-butyrALD），丙烯酸基（-Acrylate）-ACRL，疊氮基-Azide，生物素基-Biotin，熒光素基-Fluorescein，戊二酸基-GA，酰肼基-Hydrazide，炔基-Alkyne，對甲苯磺酸酯基-OTs，琥珀酰亞胺琥珀酸酯-SS等。帶有羧酸的PEG衍生物可以與N末端的胺或者賴氨酸側(cè)鏈進(jìn)行偶聯(lián)。氨基活化的PEG可以與門冬氨酸或者谷氨酸側(cè)鏈偶聯(lián)。MAL活化的PEG可以與完全脫保護(hù)的半胱氨酸側(cè)鏈的硫醇進(jìn)行偶聯(lián)。PEG修飾劑常見分類如下（注：mPEG即methoxy-PEG，CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH）：
（1）直鏈PEG修飾劑
mPEG-SC, mPEG-SCM, mPEG-SPA, mPEG-OTs, mPEG-SH, mPEG-ALD, mPEG-butyrALD, mPEG-SS
（2）雙官能團(tuán)PEG修飾劑
HCOO-PEG-COOH, NH2-PEG-NH2, OH-PEG-COOH, OH-PEG-NH2, HCl·NH2-PEG-COOH, MAL-PEG-NHS
（3）分枝形PEG修飾劑
(mPEG)2-NHS, (mPEG)2-ALD, (mPEG)2-NH2, (mPEG)2-MAL

9、多聚抗原肽（MAP）
短肽通常不具有免疫性，必須和載體蛋白耦合才能產(chǎn)生抗體。多聚抗原肽（MAP）由多個連接到賴氨酸核的相同多肽構(gòu)成，能特異性表達(dá)高效免疫原，可用來制備肽-載體蛋白耦聯(lián)體。MAP多肽可以在MAP樹脂上利用固相合成法分步合成。然而，不完整的耦合會在一些分支上產(chǎn)生遺失或截斷肽鏈，因而表現(xiàn)不出原本MAP多肽的性質(zhì)。作為替代性的方法，多肽可以單獨制備和純化然后再耦聯(lián)到MAP上。連接到多肽核心上的多肽序列是明確的，并且很容易通過質(zhì)譜表征。

10、異戊二烯化
異戊二烯化發(fā)生在C末端附近側(cè)鏈上的半胱氨酸殘基。蛋白質(zhì)的異戊二烯化可以提高細(xì)胞膜親和性，形成蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。異戊二烯化的蛋白質(zhì)包括酪氨酸磷酸酶、小GTP酶、協(xié)同伴侶分子、核纖層和著絲粒結(jié)合蛋白。異戊二烯化的多肽可以利用樹脂上的異戊二烯化方法或者引入半胱氨酸衍生物制備。

結(jié)語：
多肽修飾是一種設(shè)計多肽的重要手段，經(jīng)過化學(xué)修飾的多肽不僅可以維持較高的生物活性, 而且能夠有效地避免免疫原性和毒性方面的缺點，同時化學(xué)修飾可以賦予多肽一些新的優(yōu)良性能。肽谷生物經(jīng)常長期不斷的摸索與創(chuàng)新，在多肽修飾方面積累的大量寶貴經(jīng)驗，同時也為廣大科研工作者提供了大量的高品質(zhì)修飾多肽與優(yōu)良的售前收貨服務(wù)，肽谷生物竭誠歡迎您的咨詢！