HE染色常見問題與解決對(duì)策

HE染色，是法蘇木精 - 伊紅染色法 ( hematoxylin-eosin staining )  簡稱，石蠟切片技術(shù)里常用的染色法之一 。蘇木精染液為堿性 ，主要使細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)的核酸著紫藍(lán)色 ;伊紅為酸性染料 ，主要使細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)中的成分著紅色 。
             
1、切片在脫蠟后出現(xiàn)大片白色的斑點(diǎn)
原因:（1）烤(烘)片溫度太低，玻片在脫蠟前沒有充分烤(烘)干；（2）切片在二甲苯停留時(shí)間不足；（3）二甲苯使用過久，造成脫蠟不完全。
對(duì)策: 如果玻片是由于沒有烤(烘)干 ,先用無水乙醇處理去除玻片上的水分，然后重新用二甲苯進(jìn)行脫蠟處理。如果烤(烘)干不足的現(xiàn)象比較嚴(yán)重，可能導(dǎo)致切片脫落，則無法補(bǔ)救。如果白色斑點(diǎn)是由于切片在二甲苯停留時(shí)間不足造成，或使用的二甲苯過久，切片則需退回到二甲苯操作步驟，使其停留時(shí)間相對(duì)長些，或更換二甲苯，進(jìn)行重新染色。

2、細(xì)胞核染色暗淡，即蘇木精染色太淡
原因:（1）切片在蘇木精染色液停留時(shí)間太短；（2）蘇木精染色液過度氧化，失去染色能力，不能再繼續(xù)使用； （3）分化步驟處理時(shí)間過長。如果是骨組織細(xì)胞核暗淡，則多數(shù)是由于脫鈣過度造成。
對(duì)策：切片重新染色。如果組織在固定液固定時(shí)間過長，細(xì)胞核染色能力將減弱，須增加其在蘇木精染色液的時(shí)間，或用一些方法增加組織的嗜堿性，以改善細(xì)胞核的著色。

3、細(xì)胞核過染，即蘇木精染色太深，甚至蘇木精染液的分布占據(jù)了細(xì)胞質(zhì)的位置
原因：（1）切片在蘇木精染色液停留過長；（2）切片太厚；（3）分化步驟時(shí)間太短。
對(duì)策：如果切片不是因?yàn)樘�厚，�?duì)切片進(jìn)行重新染色，對(duì)于染色和分化時(shí)間做些適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。如果確定是由于切片太厚導(dǎo)致的細(xì)胞核過染，則需要重新切片。

4、細(xì)胞核呈紅、棕色改變
原因：蘇木精染色液過度氧化和切片在蘇木精染液染色后返藍(lán)不足。
對(duì)策：首先，每次染色之前檢查蘇木精染色液的染色能力，發(fā)現(xiàn)氧化過度應(yīng)及時(shí)更換。其次，可用流水、溫水或弱堿性溶液如稀氨水、0. 2%碳酸氫鈉等，在蘇木精染色后，給切片以足夠的藍(lán)化時(shí)間。

5、伊紅著色淡
原因：（1）伊紅染液的pH值可能大于5；（2）藍(lán)化液殘留過多；（3）切片太薄；（4）切片經(jīng)伊紅染色后在乙醇脫水時(shí)間過長。
對(duì)策：檢查伊紅染液的pH值，如果必要的話，用乙酸將其調(diào)節(jié)在4～5之間，從而使伊紅染色色彩艷麗。確保每次藍(lán)化步驟完成后，使用的弱堿性溶液被充分洗去，玻片上沒有殘留的弱堿性溶液。檢查切片的厚度。脫水時(shí)不要讓切片在低濃度乙醇停留時(shí)間過長，因?yàn)楹�水多的低濃度乙醇�?huì)將伊紅的顏色分化掉。

6、細(xì)胞質(zhì)過染
原因：（1）伊紅染色液濃度太高，特別是焰紅燃料、四溴四氯熒光素鈉的存在；（2）切片在伊紅染色時(shí)間過長；（3）切片在伊紅染色后經(jīng)乙醇脫水步驟時(shí)過的太快，而使乙醇分化伊紅的作用不能產(chǎn)生。
對(duì)策：適當(dāng)稀釋伊紅染色液，減少伊紅染色時(shí)間，或者使切片在乙醇脫水等步驟時(shí)，停留時(shí)間相對(duì)均勻。同樣，也要檢查切片的厚度是否合適。

7、切片中出現(xiàn)藍(lán)黑色沉淀物
原因：蘇木精染色液中的金屬膜，黏附在玻片上。
對(duì)策：每天染色前仔細(xì)過濾蘇木精染色液，或建議使用半氧化蘇木精染色液，如Gill蘇木精染色液,可以避免過多的金屬膜產(chǎn)生。

8、顯微鏡下見切片內(nèi)有大量水珠
原因：切片經(jīng)梯度乙醇處理后沒有完全脫水，導(dǎo)致二甲苯透明中性樹膠封固后殘留大量水分。
對(duì)策：移去蓋玻片，用二甲苯溶解封固劑如中性樹膠。將切片置入新鮮的無水乙醇中，待切片重新脫水完全后，用新二甲苯透明，中性樹膠封固。所有用于脫水和透明的液體，在使用一定時(shí)間以后，應(yīng)即時(shí)更換。

9、光鏡下切片某些區(qū)域難以聚焦
原因：蓋玻片上可能有封固切片的封固劑。
對(duì)策：移去蓋玻片，重新用干凈的蓋玻片封片。

10、封固劑從蓋玻片與載玻片之間的縫隙回縮
原因：（1）蓋玻片彎曲或不平整；（2）封固劑含二甲苯過多，稀釋過度。
對(duì)策：移去蓋玻片，重新找一張蓋玻片，用干凈的封固劑封片。每天保證盛裝封固劑的容器密封性良好，在封固結(jié)束的時(shí)候蓋緊蓋子。盡量使用小的容器盛裝封固劑，一旦封固劑太粘稠，就可以廢棄不再使用。

11、切片從脫蠟的二甲苯經(jīng)過梯度乙醇進(jìn)入水溶液時(shí)，水和玻片呈現(xiàn)乳白色混濁改變
原因：用于脫蠟的二甲苯?jīng)]有被乙醇洗干凈。
對(duì)策：更換洗滌二甲苯的乙醇液體，把切片重新放回?zé)o水乙醇，脫去玻片上的水分。

12、細(xì)胞核灰藍(lán)
原因：（1）組織處理溫度過高、過熱，在石蠟停留的時(shí)間過長；（2）固定時(shí)間太短，接下來就直接在高濃度的乙醇中行脫水處理。
對(duì)策：理論上來說，加熱處理僅在組織浸蠟步驟才使用，組織不能在熱的蠟液中停留過長時(shí)間。如果由于某些原因不能進(jìn)行下步包埋處理，完成浸蠟處理后的組織，可將組織連同塑料包埋盒一并放置在室溫空氣中，冷卻凝固，以備包埋。待需要包埋時(shí)再重新加溫直至石蠟融化即可。組織在處理前必須確保固定良好，脫水最好能從低濃度的乙醇開始。

13、切片中出現(xiàn)類似色素樣的點(diǎn)狀結(jié)晶和黑色光滑的細(xì)胞核
原因：切片封片前放置在空氣中時(shí)間太長，以至于二甲苯揮發(fā)切片干燥所致。
對(duì)策：移去組織切片上的蓋玻片和封固劑，重新處理。將切片水洗數(shù)分鐘，然后重新脫水、透明、封固。封片過程中要保持組織切片的輕度濕潤，盡量不要讓其干燥。