Cyanine 染料的分類、活化基團(tuán)的選擇和標(biāo)記反應(yīng)操作

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CY 為花菁 (Cyanine) 的縮寫，經(jīng)典的菁染料含有兩個(gè)含氮雜環(huán)，分子內(nèi)部含有由甲川基 (CH)n 組成的共軛鏈，n 可為奇數(shù)或偶數(shù)。吸光度和熒光波長(zhǎng)可通過選擇聚次甲基橋的長(zhǎng)度來(lái)控制：越長(zhǎng)的花菁素具有較高的吸光度和發(fā)射波長(zhǎng) (圖 1 所示)。根據(jù)鏈中的碳原子數(shù)，菁類由甲川基被分為一甲基 (CY1，n=0)、三甲基 (CY3，n=1)、五甲基 (CY5，n=2) 和七甲基 (CY7，n=3)。

圖 1. 經(jīng)典花菁素結(jié)構(gòu)及發(fā)射光譜示意圖

CY 染料的分類

CY 染料分為非磺化花菁和磺化花菁。兩者的光譜特性基本相同，在 DNA 和蛋白質(zhì)的標(biāo)記中，它們是可互換的，兩種均可用于標(biāo)記生物分子�；腔ㄝ既玖暇唧w水溶性，且不易在水中聚集，是抗體和蛋白標(biāo)記的第一選擇。

圖 2. 共聚焦顯微鏡觀察患者腎、肝和腫瘤的組織切片中 Cy5 的攝取情況^[3]

文中所用 Cy5 來(lái)自 MCE

CY 活化基團(tuán)的選擇

根據(jù)需要標(biāo)記的生物分子的可標(biāo)記基團(tuán) (胺基、醛基或巰基) 以及酸堿性，選擇相應(yīng)的活化染料和反應(yīng)條件。為減少空間位阻影響，CY 染料常做各種修飾，具體如下： 1) Succinimidyl ester (SE) 修飾：該類型 CY 染料可與蛋白的氨基末端或伯胺反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)包括多肽、抗體等的蛋白標(biāo)記。標(biāo)記反應(yīng)相對(duì)于游離酸形式，空間位阻更小，反應(yīng)更加穩(wěn)定，高效；如 Shiqi Huang 等人研制出一種經(jīng)過修飾的納米載體，用于治療因黑色素瘤導(dǎo)致的肺部腫瘤，研究人員用 Cy5-SE 標(biāo)記了四種修飾的納米顆粒導(dǎo)入小鼠體內(nèi)，并觀察肺部熒光圖像，進(jìn)而確定納米顆粒的聚集情況。結(jié)果表明，小鼠的肺部有大量的 Cy5-SE 標(biāo)記的納米顆粒靶向聚集，延緩了腫瘤的生長(zhǎng)，該文章用熒光標(biāo)記的方法證明了納米載體抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)的可靠性。

圖3. CY5-SE 標(biāo)記四種修飾載體蛋白的熒光圖像^[2]

2) Hydrazide (酰肼) 修飾：該類型 CY 染料可與蛋白等生物分子的醛基反應(yīng)，多用于神經(jīng)元細(xì)胞的電極失蹤和神經(jīng)縫隙連接硏究；該類型 CY 染料還可用于糖基化抗體的標(biāo)記；如 J.E.Noble 等用 Hydrazide 修飾的 CY3對(duì)四種糖基化抗體進(jìn)行偶聯(lián) (半乳糖、唾液酸、N 乙酰氨基葡萄糖和甘露糖)，得到穩(wěn)定的 CY3-Hydrazide 標(biāo)記抗體。3) Maleimide (馬米酰亞胺) 修飾：該類型 CY 染料可與蛋白等生物分子的巰基反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)高效標(biāo)記。

CY 花菁類染料優(yōu)點(diǎn)

1) 光譜窄，信號(hào)強(qiáng)；

2) 花菁類染料的摩爾吸光系數(shù)高于其他熒光染料；3) 磺化花菁類染料易溶于水，對(duì)組織細(xì)胞毒性小，適用于動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)；

4) 熒光波段在近紅外區(qū)段的組織透過性更好。

標(biāo)記反應(yīng)操作

以 NHS 活化脂 CY 標(biāo)記蛋白為例，如下圖所示：

圖 3. CY 標(biāo)記蛋白操作流程將蛋白溶液與配置好的染料工作液倒入反應(yīng)溶劑中 → 用移液器上下輕打混勻 → 常溫下靜置或輕微混動(dòng)反應(yīng) 3-5 個(gè)小時(shí) (可過夜) → 反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行透析除去未標(biāo)記染料 → 避光放置在 4°C 保存

ProductName	λex/λem	Description
Cy2	488/520	是一種花青染料，可標(biāo)記多肽，蛋白和寡核苷酸種的氨基。
Cy2-SE (iodine)	488/520	Cy2-SE (iodine) 為 Cy2 的 SE 修飾所得，可標(biāo)記多肽、蛋白和寡核苷酸中的氨基。
Cy3-N3	555/580	Cy3 (Cyanine 3) 是一種發(fā)橘黃色熒光的花青素?zé)晒馊玖稀？梢杂?530nm-561nm 的激光束激發(fā)后用 TRITC 的濾片觀察。
Cy 3 Non-Sulfonated	555/580	Cy3-N3 是 Cy3 疊氮化物熒光染料，用于多肽、蛋白和寡核苷酸中的氨基。
Cy3-YNE	555/580	CY3-YNE (Sulfo-Cyanine3-alkyne) 是一種染料，可用于標(biāo)記可溶性蛋白、肽和寡核苷酸/ DNA。
Cy5	659/670	Cy5 是明亮的紅色熒光染料，用于標(biāo)記肽，蛋白質(zhì)，寡核苷酸的氨基基團(tuán)的反應(yīng)染料。
Cy5-SE	659/670	Cy5-SE (Cy5 NHS Ester) 是一種用于標(biāo)記肽，蛋白質(zhì)，寡核苷酸的氨基基團(tuán)的反應(yīng)染料。
Cy5.5	673/707	Cy5.5 (Sulfo-Cyanine5.5) 是用于標(biāo)記生物分子的近紅外熒光染料，可用于小動(dòng)物體內(nèi)成像，也常常適用于對(duì)背景熒光干擾的實(shí)驗(yàn)。
Cy5.5-SE	673/707	Cy5.5-SE (Cyanine5.5 NHS ester) 為 CY5 的 NHS 修飾所得，可標(biāo)記多肽、蛋白和寡核苷酸中的氨基。
Cy7-SE	720/790	CY7-SE (Sulfo-Cyanine7 Succinimidyl Ester) 是一種近紅外熒光標(biāo)記試劑，常用于小動(dòng)物體內(nèi)成像，也用來(lái)標(biāo)記核酸，蛋白，多肽，納米粒，多聚物等。

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參考文獻(xiàn)

1.. X Shi, Y Jung, LJ Lin, C Liu, C Wu, IKO Cann, Quantitative fluorescence labeling of aldehyde-tagged proteins for single-molecule imaging Nat Methods. 2012 Apr 1;9(5):499-503

2. JE Noble, E Cerasoli.Fluorescent labeling of protein analysis.

3. Arindam Pramanik, Zexi Xu, Shazana H Shamsuddin, et al. Affimer Tagged Cubosomes: Targeting of Carcinoembryonic Antigen Expressing Colorectal Cancer Cells Using In Vitro and In Vivo Models. ACS Appl Mater Interfaces. 2022 Mar 9;14(9):11078-11091.

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