細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞污染和藥物析出的表現(xiàn)和應(yīng)對(duì)方法

細(xì)胞培養(yǎng) (Cell culture) 也叫細(xì)胞克隆技術(shù)，是指在體外模擬體內(nèi)環(huán)境，使之生存、生長(zhǎng)、繁殖并維持主要結(jié)構(gòu)和功能的一種方法。細(xì)胞培養(yǎng)是細(xì)胞和分子生物學(xué)中使用的關(guān)鍵工具，可以對(duì)細(xì)胞的生理學(xué)和生物化學(xué)進(jìn)行建模，是生命科學(xué)研究中常用的研究手段。

 

圖 1. 人輸卵管組織原代細(xì)胞培養(yǎng)^[1]

   

要想擁有一株健康的細(xì)胞，主打 8 個(gè)字 “悉心照料，小心呵護(hù)”；它就是你實(shí)驗(yàn)生涯中的 “愛(ài)寶”。盡管愛(ài)護(hù)備至，拋開絲滑的無(wú)菌操作技術(shù)，污染的因素還是防不勝防：細(xì)胞復(fù)蘇過(guò)程的水浴，細(xì)胞培養(yǎng)箱層，水盤，培養(yǎng)箱柜門，包括各種實(shí)驗(yàn)儀器的蓋子周圍，這些都可能會(huì)為污染帶來(lái)風(fēng)險(xiǎn)。如下圖，不知受何因素污染的細(xì)胞和正常的細(xì)胞形態(tài)和狀態(tài)有著鮮明的對(duì)比。細(xì)胞污染的種類一般可分成細(xì)菌、真菌，支原體污染等。

 

 
細(xì)菌污染是細(xì)胞培養(yǎng)中最常見(jiàn)的污染，常見(jiàn)的有枯草桿菌、大腸桿菌、分歧桿菌以及葡萄球菌污染等。它們的污染肉眼可見(jiàn)：細(xì)胞培養(yǎng)基還會(huì)隨著細(xì)菌負(fù)荷的增加，變得渾濁，含有 pH 值指示物 (如中性或酚紅) 的培養(yǎng)液會(huì)因細(xì)菌污染而酸化 (即變得更黃)。大多細(xì)菌在顯微鏡下觀察呈現(xiàn)桿狀和顆粒狀形態(tài)，并且可以移動(dòng)，光學(xué)顯微鏡下也可以觀察到，例如下圖細(xì)胞培養(yǎng)中分枝桿菌污染導(dǎo)致漂浮的團(tuán)塊。 

圖 3. 分歧桿菌污染的細(xì)胞^[3]

 

 
真菌污染，比如霉菌污染和酵母菌污染等。一般受真菌污染的細(xì)胞，培養(yǎng)液是清亮的，但會(huì)出現(xiàn)絮狀雜質(zhì)，顯微鏡下觀察道細(xì)絲狀結(jié)構(gòu)，可看到明顯的菌絲，酵母可能表現(xiàn)為非常小的圓形細(xì)胞(單鏈或短鏈)，還可能出現(xiàn)出芽。污染不嚴(yán)重的情況下細(xì)胞仍可生長(zhǎng)，但受污染細(xì)胞的活力狀態(tài)明顯變差。

圖 4. 酵母，青霉素等在光學(xué)顯微鏡下的外觀^[3] 

 

 
 
 

MCE 小貼士：

用于細(xì)胞培養(yǎng)的器皿和培養(yǎng)液都需要嚴(yán)格無(wú)菌。若實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所需的藥物不建議被高溫高壓和輻照殺菌， 建議使用 0.22 μm 的濾膜過(guò)濾除菌，可有效避免真菌和細(xì)菌污染。

針對(duì)細(xì)菌污染，在培養(yǎng)基中，加入青霉素-鏈霉素雙抗，慶大霉素，氨芐青霉素或者卡那霉素等抗生素進(jìn)行處理，可有效抑制多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的生長(zhǎng)，從而有效控制細(xì)胞污染。預(yù)防霉菌污染可在培養(yǎng)基里加兩性霉素或制霉菌素或放線菌素 D。

但無(wú)論是哪種污染， 一旦發(fā)生，很難完全去除細(xì)胞中的微生物污染，預(yù)防永遠(yuǎn)大于善后！

   

支原體污染可以改變細(xì)胞的特性，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)論不可靠。支原體是最小的獨(dú)立生存生物，不能用可見(jiàn)光顯微鏡進(jìn)行肉眼檢查，因此可以在細(xì)胞培養(yǎng)物中長(zhǎng)時(shí)間不被發(fā)現(xiàn)。它會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞參數(shù)的改變 (例如，染色體畸變，代謝和細(xì)胞生長(zhǎng)的變化)，導(dǎo)致不可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (如下圖紅外顯微鏡下，DBTRG 細(xì)胞被支原體感染24小時(shí)候的形態(tài)變化)。 

 

 
支原體的污染可以通過(guò)專項(xiàng)檢測(cè)，例如 PCR 或 DNA 熒光染色來(lái)檢測(cè)這類污染。
 

 
 
 

MCE 小貼士：

支原體污染細(xì)胞后，由于支原體體積很小，無(wú)法通過(guò)過(guò)濾的辦法去除。如果不是極其難得的細(xì)胞，建議還是扔了吧。如果還想救一救，需要注意的是支原體沒(méi)有細(xì)胞壁，因此對(duì)作用于細(xì)胞壁合成的抗生素是不敏感的。四環(huán)素類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素對(duì)支原體有很好的抑制活性。

支原體清除試劑 BM-Cyclin 有效抑制和清除在細(xì)胞培養(yǎng)中廣泛存在的支原體污染，包括口腔支原體 Mycoplasma orale、精氨酸支原體 Mycoplasma arginini、豬鼻支原體 Mycoplasma hyorhinis 等，從而挽救受到污染的珍貴細(xì)胞。 

 

介紹完細(xì)胞培養(yǎng)常見(jiàn)污染種類之后，大家是不是有了一個(gè)初步概念了呢？但是，還有一種情況，從 “照騙” 來(lái)看， 妥妥的藥物析出。

   
由于很多小分子水溶性不好，常用有機(jī)溶劑，如 DMSO 配制母液，再稀釋到培養(yǎng)基孵育細(xì)胞。稀釋的過(guò)程中由于產(chǎn)品溶解性、溫度、濃度等因素的影響，很容易出現(xiàn)藥物析出，在顯微鏡下觀察：一般會(huì)呈現(xiàn)出針狀，雪花狀或者點(diǎn)狀結(jié)晶。有些童鞋就一不小心誤認(rèn)為是真菌菌絲了。

   
 
 

MCE 小貼士：

為避免藥物析出，稀釋前，可將母液和培養(yǎng)基 37℃ 預(yù)熱，避免溫度低造成嚴(yán)重析出。若稀釋過(guò)程中出現(xiàn)化合物析出的情況， 可采用超聲加熱的方法使其復(fù)溶。

 

現(xiàn)在大家是不是能很好的區(qū)分藥物析出和細(xì)胞污染及其種類了呢？以后遇到鏡下觀察有 “污染”，不要直接 “棄療”，先判斷一下是否為藥物析出，興許還有救~
 
 

相關(guān)產(chǎn)品

支原體清除試劑 BM-Cyclin 主要成分為延胡索酸泰妙菌素 (Tiamulin fumarate) 和鹽酸米諾環(huán)素 (Minocycline hydrochloride)，可在不影響細(xì)胞狀態(tài)的前提下，有效抑制和清除在細(xì)胞培養(yǎng)中廣泛存在的支原體污染，對(duì)于常見(jiàn)的革蘭氏陰性和陽(yáng)性菌也有一定的清除作用。

青霉/鏈霉素雙抗溶液 已過(guò)濾除菌，可直接用于細(xì)胞培養(yǎng)的雙抗溶液。產(chǎn)品添加到細(xì)胞培養(yǎng)液中， 可有 效抑制多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的生長(zhǎng)，從而有效控制細(xì)胞污染。青霉素-鏈霉素溶液 (100×) 中，含有青霉素 G 鈉鹽 10 KU/mL，硫酸鏈霉素 10 mg/mL。

兩性霉素 B 無(wú)菌溶液 一種多烯類抗真菌抗生素， 破壞真菌正常代謝并引起死亡，從而用于抑制真菌和酵母的污染。

慶大霉素?zé)o菌溶液 慶大霉素通過(guò)與細(xì)菌核糖 體 30S 亞基結(jié)合阻斷細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，可有效抑制多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌和 革蘭氏陰性菌的生長(zhǎng)。  細(xì)胞培養(yǎng)液中，慶大霉素的推薦工作濃度為 0.5-50 μg/mL。

抗生素-抗真菌素溶液 含青霉素 (10 KU/mL)、鏈霉素 (10 mg/mL)、兩性霉素 B (25 μg/mL)。青霉素-鏈霉素可有效抑制多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的生長(zhǎng)，兩性霉素 B 可用于抑制真菌、酵母的污染。

潮霉素 B 無(wú)菌溶液 氨基糖苷類抗生素，主要通過(guò)干擾 70 S 核糖體易位和誘導(dǎo)對(duì) mRNA 模板的錯(cuò)讀而抑制細(xì)胞蛋白質(zhì)的正常合成，從而導(dǎo)致細(xì)菌、真菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞死亡。

MCE 的所有產(chǎn)品僅用作科學(xué)研究或藥證申報(bào)，我們不為任何個(gè)人用途提供產(chǎn)品和服務(wù)
 
 

參考文獻(xiàn)

 

 

[1] Fotheringham S, Levanon K, Drapkin R. Ex vivo culture of primary human fallopian tube epithelial cells. J Vis Exp. 2011 May 9;(51):2728.
 
[2] Selcen Çelik-Uzuner, Uğur Uzuner. An Extensive Method for Maintenance of Sterility in Mammalian Cell Culture Laboratory Routine. Challenges 2017, 8(2), 26  
 
[3] Raymond W Nims, Paul J Price. et al. Best practices for detecting and mitigating the risk of cell culture contaminants . 2017 Dec;53(10):872-879.   
 
[4] Katia Wehbe , Marzia Vezzalini, Gianfelice Cinque. Detection of mycoplasma in contaminated mammalian cell culture using FTIR microspectroscopy. Anal Bioanal Chem. 2018 May;410(12):3003-3016.   
 
[5] Cord C Uphoff , Hans G Drexler. Detecting Mycoplasma contamination in cell cultures by polymerase chain reaction. Methods Mol Med. 2004;88:319-26. 
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