細(xì)胞器脂滴的生物發(fā)生和在檢測(cè)中的相關(guān)應(yīng)用

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脂滴的結(jié)構(gòu)

脂滴 (Lipid droplets, LDs) 是一種呈球狀的細(xì)胞器，也稱(chēng)為脂質(zhì)體或油體。與其他細(xì)胞器不同，脂滴的表面是單層的磷脂膜，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，脂滴單分子膜的主要成分是磷脂酰膽堿 (Phosphatidylcholine, PC)，高達(dá)60%，其次是磷脂酰、磷脂酰肌醇等^[1] 。在磷脂膜上有超過(guò) 200 種不同的結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白定位于 LDs 的表面，如 DGAT2、Rab18、脂滴包被蛋白 (Perilipin) 和 CCT 等，調(diào)節(jié) LD 內(nèi)穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞內(nèi)相互作用^[2,3] 。脂滴的核心是中性脂質(zhì)，如三酰甘油酯 (Triacylglycerols, TAG) 和甾醇酯 (Sterol esters, SE) 等，沉積在脂滴中，在白色脂肪細(xì)胞中，TAG 主要以脂類(lèi)酯的形式儲(chǔ)存在脂滴中，而在類(lèi)固醇細(xì)胞中，SE 是主要成分，此外，根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型的不同，許多其他內(nèi)源性中性脂質(zhì)如視黃醇酯、醚脂質(zhì)和游離膽固醇也儲(chǔ)存在脂滴核內(nèi)^[4] 。

圖 1. 脂滴的結(jié)構(gòu)特征^[4]

脂滴的生物發(fā)生

由于脂滴特殊的親水/疏水兩性結(jié)構(gòu)，科學(xué)家對(duì)其的產(chǎn)生一直在不斷的進(jìn)行中，目前廣泛認(rèn)為，在原核生物中，中性脂質(zhì)的積累是在質(zhì)膜的特定脂質(zhì)結(jié)構(gòu)域開(kāi)始的，最后形成了細(xì)胞質(zhì)脂滴。在真核生物中，脂滴發(fā)生于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的磷脂雙分子層的小葉內(nèi)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)雙分子層之間累積的中性脂的體積增加超過(guò)了溶解度的極限，脂滴即從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)雙分子層中被油化出來(lái)^[5,6] 。

^{圖 2. 原核生物和真核生物中脂體形成的模型}^[6]

在原核生物中，中性脂質(zhì)體的形成始于 WS/DGAT 附著在細(xì)胞質(zhì)膜上，隨后合成小脂滴，形成被單層 PLs 包裹的產(chǎn)油層。脂質(zhì)體前體由 SLD 聚集和融合形成，形成膜結(jié)合的脂質(zhì)體前體，然后形成細(xì)胞質(zhì)脂質(zhì)體。真核生物的油體是由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的兩個(gè)小葉之間的脂質(zhì)漸進(jìn)式積累形成的，并可能有結(jié)構(gòu)蛋白的共翻譯插入，從而形成出芽的油體并釋放到細(xì)胞質(zhì)中。

脂滴的功能

許多生物在細(xì)胞中儲(chǔ)存脂質(zhì)以產(chǎn)生代謝能量，以防能量來(lái)源不足。但脂滴不是簡(jiǎn)單的脂質(zhì)儲(chǔ)存庫(kù)，而是具有多種細(xì)胞功能的復(fù)雜細(xì)胞器^[7] 。除了在能量代謝中發(fā)揮作用外，脂滴也是細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間脂肪酸運(yùn)輸?shù)闹匾?jié)點(diǎn)，還在各種細(xì)胞事件中發(fā)揮作用，如蛋白質(zhì)降解、隔離轉(zhuǎn)錄因子和染色質(zhì)成分以及為某些核受體生成脂質(zhì)配體^[8] 。此外，病毒核衣殼蛋白核心本身可與脂滴表面結(jié)合并協(xié)調(diào)病毒感染的持續(xù)傳播^[9] 。

脂滴相關(guān)檢測(cè)

由于脂滴功能的多樣性，其異常與許多病理狀態(tài)相^[10] 。因此，了解脂滴的生物學(xué)特性和功能便尤為重要。下面小 M 就來(lái)為大家介紹一下脂滴常用的染料檢測(cè)。

■ 油紅 O (Oil Red O) 染色
脂質(zhì)代謝改變和腎臟內(nèi)的過(guò)度脂質(zhì)沉積被認(rèn)為是腎臟疾病進(jìn)展的重要有害因素，據(jù)報(bào)道，自噬可通過(guò)誘導(dǎo)脂質(zhì)分解和促進(jìn)脂滴形成的雙向機(jī)制參與脂代謝調(diào)控。
Beclin-1 是自噬體的標(biāo)記物，為驗(yàn)證 Beclin-1 與纖維化腎小管上皮細(xì)胞 (Tubular epithelial cells, TECs) 自噬誘導(dǎo)的脂質(zhì)積累是否有關(guān)，通過(guò) Oil Red O 染色觀(guān)察在TGF-β1(可引起自噬激活和脂質(zhì)積累) 刺激下，Beclin-1 敲低的 HK-2 細(xì)胞中脂質(zhì)沉積。結(jié)果顯示，TGF-β1 刺激下，Ctrl siRNA 轉(zhuǎn)染的 HK-2 細(xì)胞的脂質(zhì)水平升高，但在 Beclin-1 敲除的 HK-2 細(xì)胞中脂質(zhì)水平不顯著 (圖 3)。以上表明，Beclin-1 參與了自噬誘導(dǎo)的 LDs 在腎纖維化的 TECs 中的積累。

^{圖 3. 油紅 O 染色細(xì)胞的圖像處理}^[11]

油紅O (Oil Red O) 染色是一種簡(jiǎn)單的定性方法，當(dāng)油紅 O 與脂滴接觸時(shí),會(huì)直接進(jìn)入細(xì)胞/組織內(nèi)脂質(zhì)中，使其染為紅色。

步驟(參考)：1. 將腎組織或細(xì)胞玻片的冰凍切片在 PBS 中洗滌，多聚甲醛固定 30 min。2. 樣品在 60% 異丙醇中孵育 3 min，然后用新鮮制備的 60% 油紅 O 染色 30 min, 60% 異丙醇染色 1 min，用 PBS 洗滌。3. 樣本用蘇復(fù)染。切片使用顯微鏡進(jìn)行可視化。4. 使用 Image J 軟件按照標(biāo)準(zhǔn)程序?qū)χ螖?shù)量和大小進(jìn)行定量。

■ 尼羅紅(Nile Red) 染色
除油紅 O 染色以外，Nile Red 也是一種常用的熒光探針，能夠定位及定量細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)。如，在研究未羧化骨鈣素 (Uncarboxylated osteocalcin, GluOC) 對(duì)肝細(xì)胞作用的機(jī)制時(shí)，以油酸/棕櫚酸 (Oleic acid/Palmitic acid, OA/PA) 誘導(dǎo)的細(xì)胞作為非酒精性脂肪性肝病細(xì)胞模型，通過(guò) Nile Red 染色檢測(cè)三酰甘油水平。結(jié)果顯示，GluOC 降低了甘油三酯水平。表明 GluOC 抑制了 OA/PA 誘導(dǎo)的 NCTC 1469 細(xì)胞中的脂質(zhì)積累。

^{圖 4. Nile Red 染色染色來(lái)監(jiān)測(cè) GluOC 處理后的細(xì)胞內(nèi)脂滴}^[12]

Nile Red 又叫尼羅紅，是一種親脂性的惡嗪類(lèi)熒光探針，在水中和其他極性溶液中不發(fā)熒光，在非極性溶劑中出現(xiàn)明亮的紅色熒光，能夠定位及定量細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)。

步驟 (參考)：1. PBS 洗滌樣本 3 次， 4% 多聚甲醛固定 15 min，然后用 0.5% Triton X-100 處理 15 min。2. 用 Nile Red 工作液在室溫下染色 60 分鐘。3. 染色結(jié)束，去除多余的染料，用 PBS 洗滌細(xì)胞 3 次。4. 使用光學(xué)顯微鏡拍攝照片。

■ BODIPY 脂滴類(lèi)染料
此外，BODIPY 類(lèi)染料也是脂滴標(biāo)記的染料，最大特點(diǎn)是其非對(duì)稱(chēng)性，可以很好的連接標(biāo)記基團(tuán) (比如親脂類(lèi)結(jié)構(gòu))，穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，通過(guò)在細(xì)胞內(nèi)的極性脂類(lèi)上定位以進(jìn)行特異性染色。BODIPY 類(lèi)染料可用于標(biāo)記活細(xì)胞和固定細(xì)胞，還可用于光動(dòng)力學(xué)療法的研究。
如，研究設(shè)計(jì)成熟的脂肪細(xì)胞 (Apo) 包裹棕櫚酸結(jié)合的雷公藤甲素衍生物 (pTP) 和光敏劑 Ce6 (pTP-Ce6-Apo)，用于黑色素瘤的光動(dòng)力學(xué)治療。為探討 pTP-Ce6-Apo 能否將脂肪細(xì)胞內(nèi)的脂滴轉(zhuǎn)運(yùn)到 A375 細(xì)胞內(nèi)，以及 pTP-Ce6-Apo 能否釋放 Ce6 并被 A375 細(xì)胞攝取，使用 BODIPY 505/515 染色 pTP-Ce6-Apo。結(jié)果顯示 A375 細(xì)胞周?chē)植贾倭康闹�，表�?A375 細(xì)胞可以從脂肪細(xì)胞中攝取脂滴并為自己所用。同時(shí)，A375 細(xì)胞核周?chē)猩倭考t色熒光為 Ce6，表明 Ce6 從 pTP-Ce6-Apo 中成功釋放并被 A375 細(xì)胞攝取。

^{圖 5. pTP-Ce6-Apo的脂滴和Ce6與A375細(xì)胞核共定位}^[13]

BODIPY，也叫硼，BDP，是以硼二 (boron-dipyrromethene) 為熒光結(jié)構(gòu)母核的染料。其對(duì)環(huán)境的極性和 pH 值相對(duì)不敏感，因此，在不同生理?xiàng)l件下相對(duì)穩(wěn)定。

步驟 (參考)：1. 將 BODIPY 標(biāo)記的 pTP-Ce6-Apo 置于 Transwel l小室上層，A375 細(xì)胞玻片置于底層。共培養(yǎng)后，取出 A375 細(xì)胞片。2. 用多聚甲醛固定，避光后染色。3. 在激光共聚焦顯微鏡下觀(guān)察制備的 A375 細(xì)胞片。

下面是小 M 為大家整的一些 Bodipy 類(lèi)相關(guān)染料，方便大家更好地進(jìn)行脂質(zhì)代謝相關(guān)研究~

表 1. Bodipy 類(lèi)相關(guān)脂滴染料

Product Name	Ex/Em (nm)
BODIPY 493/503 methyl bromide	493/503
BODIPY 493/503	493/503
BODIPY 505/515	505/515
BODIPY 500/510 C1, C12	500/510
BODIPY FL C12	480/508
BODIPY 558/568 C12	558/568

相關(guān)產(chǎn)品

Nile Red
尼羅紅 (Nile Red) 是一種親脂染色。它具有環(huán)境敏感性熒光。尼羅紅在富脂環(huán)境中熒光強(qiáng)烈，而在水介質(zhì)中熒光微弱。它是熒光顯微鏡和流式細(xì)胞熒光法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂滴的極好的重要染色劑。尼羅紅將細(xì)胞內(nèi)脂滴染成紅色。熒光波長(zhǎng) 559/635 nm。

BETA-1
BETA-1 是第一個(gè)分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移聚集誘導(dǎo)發(fā)射集成分子 (TICT-AIE integration molecule)。BETA-1 在脂滴 (LD) 中發(fā)出青色熒光，在線(xiàn)粒體中發(fā)出紅色熒光。BETA-1 可用于脂滴和線(xiàn)粒體在體內(nèi)和體外的同時(shí)和雙色成像。

Oil Red O
Oil Red O 是一種脂溶性重氮染料，最大吸收波長(zhǎng)為 518 nm。Oil Red O 染色中性脂和膽固醇酯，但不染色生物膜。Oil Red O 在小鼠肝活檢中可用于檢測(cè)和定量肝脂肪變性。Oil Red O 染色可以有效地觀(guān)察代謝疾病發(fā)生和進(jìn)展時(shí)組織發(fā)生的根本變化。

LipidGreen 2
LipidGreen 2 是用于脂質(zhì)成像的第二代小分子探針。與之前的 LipidGreen 相比，LipidGreen 2 具有更好的熒光信號(hào)，可以選擇性地染色細(xì)胞中的中性脂質(zhì)和活斑馬魚(yú)的脂肪沉積物。

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參考文獻(xiàn)
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