組織活性氧（ROS）檢測(cè)試劑盒（DHE）使用說(shuō)明書(shū)

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組織活性氧(ROS)檢測(cè)試劑盒（DHE）使用說(shuō)明書(shū)

一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
組織活性氧檢測(cè)試劑盒是一種利用熒光探針DHE進(jìn)行組織活性氧檢測(cè)的試劑盒。本試劑盒中的DHE ROS探針為紅色熒光的活性氧探針，具有510/610nm的最大激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)。DHE ROS探針在組織中活性氧存在的條件下，被氧化生成紅色熒光物質(zhì)，紅色熒光強(qiáng)度與組織內(nèi)活性氧水平成正比，檢測(cè) DHE 產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度就可以知道組織內(nèi)活性氧的水平。在激發(fā)波長(zhǎng)510nm，發(fā)射波長(zhǎng)610nm附近，使用熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀、等檢測(cè)DHE產(chǎn)物熒光，從而測(cè)定組織內(nèi)活性氧水平�；钚匝�(Reactive oxygen species, ROS)包括過(guò)氧化氫（H2O2，Hydrogen peroxide）、羥基自由基（•OH，Hydroxyl radical）、單線態(tài)氧（1O2，Singlet oxygen）、一氧化氮（NO，Nitric oxide）、超氧陰離子(•O2-，Superoxide anion)、過(guò)氧化自由基(ROO•，Peroxylradical)、過(guò)氧羥自由基（HOO•，hydroperoxyl）及其下游產(chǎn)物過(guò)氧化物過(guò)氧亞硝基陰離子（ONOO-，Peroxynitrite anion）、ClO-和羥化物等，參與細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、發(fā)育分化、衰老和凋亡以及許多生理和病理過(guò)程。

活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生主要是氧化磷酸化的結(jié)果，在呼吸鏈中，在某些位點(diǎn)會(huì)有“泄露”的電子直接和氧氣或和其他電子受體反應(yīng)，在酶或非酶作用下引發(fā) 一系列反應(yīng)生成不同種類(lèi)的活性氧：“泄露”的電子最初和氧氣反應(yīng)生成超氧陰離子自由基（O2•-）。超氧陰離子遇水生成 H2O2，同時(shí)過(guò)氧化氫也可由氧氣在單胺氧化酶（monoamine oxidase，MAO）的作用下生成，生成的過(guò)氧化氫在髓過(guò)氧化物酶（myeloperoxidase, MPO）的催化下與 Cl-反應(yīng)可生成ClO-，在鐵或銅離子的催化下發(fā)生Fenton反應(yīng)生成OH•，超氧陰離子遇氮氧化物反應(yīng)生成ONOO-。這些生成的高氧化活性的物質(zhì)統(tǒng)稱(chēng)為活性氧。

適用：新鮮組織，一般最好使用新鮮組織樣本檢測(cè)活性氧，反映的是組織當(dāng)時(shí)的活性氧狀態(tài)。凍存的組織樣本的ROS在長(zhǎng)期凍存過(guò)程中會(huì)損失掉，有條件的話(huà)就使用新鮮樣本，不建議使用凍存的組織樣本。已經(jīng)凍存的組織樣本中殘余的ROS也可以用本試劑盒檢測(cè)。

二、產(chǎn)品組成：

名稱(chēng)規(guī)格	100T	200T
勻漿緩沖液 A	100 ml	2*100 ml
DHE 活性氧探針	200 μl	2*200 μl
說(shuō)明書(shū)		一份

三、自備材料：
1、熒光分光光度計(jì)或熒光酶標(biāo)儀(激發(fā)波長(zhǎng)488-535nm，發(fā)射波長(zhǎng)610nm)
離心機(jī)，移液器，冰箱，冰盒
2、PBS 緩沖液（10mM,PH7.4 ）或者 HBSS
3、離心管，吸頭，一次性手套，熒光檢測(cè)專(zhuān)用黑色 96孔板

四、使用注意事項(xiàng):
1、螺旋蓋微量試劑管裝的試劑在開(kāi)蓋前請(qǐng)短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體收集至管底，避免開(kāi)蓋時(shí)液體灑落。
2、DHE染色液為 DMSO溶液，冬季氣溫較低時(shí)在室溫時(shí)為凝固狀態(tài)，極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱溶解，吸頭也需要放在培養(yǎng)箱預(yù)熱，否者容易再次凝固在吸頭內(nèi)壁產(chǎn)生損耗。
3、使用前，先將本品取出回溫至室溫，并對(duì)其進(jìn)行簡(jiǎn)短離心使 DMSO溶液集中于管底。
4、盡量縮短探針標(biāo)記后到測(cè)定所用的時(shí)間，以減少各種可能的誤差。

五、樣本處理：
1、剛?cè)〉玫男迈r組織樣本用pbs洗凈.
2、準(zhǔn)確稱(chēng)取50mg組織，加入1ml勻漿緩沖液A，用玻璃勻漿器充分勻漿。
3、在100xg，4℃離心3分鐘，棄沉淀，取上清。

六、樣本檢測(cè):
1、在96孔板中加入200微升勻漿上清液、2微升DHE 探針，用移液器吹打，使之充分混勻。
【注意】:
①不同樣本的活性氧差異較大，需要根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果調(diào)整探針用量。一般加入2ul探針，染色終濃度按試劑盒中探針母液的100-2000倍稀釋?zhuān)?00-1000倍稀釋適合大多數(shù)樣本。最大稀釋比例可至2000倍。
②如果熒光強(qiáng)度太強(qiáng)，超過(guò)了檢測(cè)儀器的量程，可以減少探針用量。保證所有樣本探針用量一致即可。
③以酶標(biāo)儀檢測(cè)為例。也可以用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)，根據(jù)所使用儀器決定勻漿液體積和染色容器。
④染色液為DMSO溶液，冬季氣溫較低時(shí)在室溫時(shí)為凝固狀態(tài)，極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱溶解，吸頭也需要放在培養(yǎng)箱預(yù)熱，否者容易再次凝固在吸頭內(nèi)壁產(chǎn)生損耗。
⑤微量操作時(shí)，注意探針要有效加入勻漿液，避免沒(méi)有加入。
2、在37℃避光孵育15-30分鐘。
3、置于熒光酶標(biāo)儀中，后于激發(fā)波長(zhǎng)為488-535 nm、發(fā)射波長(zhǎng)610 nm檢測(cè)熒光強(qiáng)度。
【注意】
①或使用熒光光度計(jì)等其它熒光檢測(cè)設(shè)備。
②必須使用熒光檢測(cè)專(zhuān)用的黑色96孔板。
③如果熒光強(qiáng)度太強(qiáng)，超過(guò)了儀器的檢測(cè)范圍，可以將孵育后的勻漿上清液稀釋后再檢測(cè)。一般稀釋5-50倍。

七、蛋白定量:
1. 另取50微升上清勻漿液，用PBS大約稀釋30倍。
2. 取100微升進(jìn)行蛋白定量。

八、結(jié)果處理:
以熒光強(qiáng)度（RFU)/蛋白濃度（毫克蛋白）表示組織活性氧強(qiáng)度。
【注意】:
①數(shù)據(jù)與蛋白濃度的單位無(wú)關(guān)。
②此處以蛋白濃度數(shù)據(jù)作為校正系數(shù)，對(duì)不同樣品進(jìn)行均一化處理。
③熒光強(qiáng)度強(qiáng)則活性氧（ROS）含量高。
④可以用實(shí)驗(yàn)中對(duì)照樣本的熒光強(qiáng)度值為基準(zhǔn)，待測(cè)組樣本的熒光強(qiáng)度值占對(duì)照樣本的百分比來(lái)比較活性氧（ROS）程度差異。

九、常見(jiàn)問(wèn)題分析：
①活性氧結(jié)果如何分析?
ROS是多種物質(zhì)的統(tǒng)稱(chēng)，不像某一單一活性氧指標(biāo)，無(wú)法檢測(cè)其絕對(duì)的含量，只能通過(guò)設(shè)置參照樣本，以參照樣本的倍數(shù)來(lái)反映目標(biāo)樣本相對(duì)含量變化，這個(gè)“相對(duì)”是針對(duì)參照的。分析結(jié)果是定性的，也是沒(méi)有單位的，因?yàn)樗举|(zhì)上是一個(gè)比值（目標(biāo)/參照)。反映的是模型樣本通過(guò)具體的干預(yù)措施（如養(yǎng)分缺失、缺氧、藥物治療或遺傳基因操控等）如何影響其ROS的變化，測(cè)定其ROS是增加或者降低了。
②熒光強(qiáng)度在變化?
可以觀察到熒光的逐漸增加（由于自動(dòng)氧化）或減少（由于細(xì)胞中的染料損失或光漂白)。在沒(méi)有任何刺激或誘導(dǎo)的情況下，健康的未經(jīng)處理的樣本中的熒光突發(fā)可以指示細(xì)胞死亡或一些其他氧化事件的進(jìn)展。
注意檢測(cè)時(shí)平行操作即可。

十、存儲(chǔ)：2-8℃保存
如果長(zhǎng)期不用，勻漿液2-8℃保存，探針-20℃避光保存

十一、有效期：未拆封一年，拆封請(qǐng)盡快使用完

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