聚凝胺(Polybrene)在逆轉(zhuǎn)錄病毒及慢病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用

聚凝胺（Polybrene），也稱海美溴銨 （Hexadimethrine Bromide），是一種多聚陽(yáng)離子聚合物。聚凝胺目前廣泛用于逆轉(zhuǎn)錄病毒及慢病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染，作用機(jī)理可能是通過(guò)中和細(xì)胞表面唾液酸與病毒顆粒之間的靜電排斥從而促進(jìn)吸附作用。聚凝胺也常用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的DNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)以增強(qiáng)脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率。其也是一種有名的抗肝素劑（肝素拮抗劑），用來(lái)生產(chǎn)非特異性凝集的紅細(xì)胞。另外，由于少量的聚凝胺在自動(dòng)測(cè)序分析中可以增加多肽的降解現(xiàn)象，因此聚凝胺也多用于蛋白測(cè)序。

使用方法

本品為無(wú)菌溶液，濃度為10mg/mL使用時(shí)一般按1:1000-1:2000稀釋，依細(xì)胞種類不同稀釋比例不同，具體查閱相關(guān)文獻(xiàn)或根據(jù)實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)來(lái)調(diào)整。

 

實(shí)驗(yàn)1：病毒感染

1）重組逆轉(zhuǎn)錄病毒原液的制備：取5mL生長(zhǎng)培養(yǎng)基加入約含單層轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)錄包裝細(xì)胞的100mm培養(yǎng)盤內(nèi)。孵育24h后，吸去培養(yǎng)液并用0.45μm濾器過(guò)濾；

2）待感染細(xì)胞的培養(yǎng)：100mm培養(yǎng)盤內(nèi)加入10mL完全培養(yǎng)基，細(xì)胞密度約為5×105/盤；

3）病毒感染：細(xì)胞培養(yǎng)24h后，吸去完全培養(yǎng)液。用含聚凝胺的2mL病毒上清（或?qū)⒉《驹�液稀釋�?mL）感染細(xì)胞，聚凝胺的終濃度為5μg-10μg/mL。37°C孵育3-6h；

4）收集病毒顆粒：加入8mL完全培養(yǎng)基。感染3天后，按照1:5的比例用選擇培養(yǎng)基裂解細(xì)胞。

 

實(shí)驗(yàn)2：DNA轉(zhuǎn)染

1）完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)細(xì)胞密度約50%；

2）孵育細(xì)胞18-24h后準(zhǔn)備DNA-培養(yǎng)基-聚凝胺混合液，按如下操作制備混合液：

✦ 添加完全培養(yǎng)基（60mm培養(yǎng)皿2mL，100mm培養(yǎng)皿3mL）37°C預(yù)熱；

✦ 添加10ng~10µg質(zhì)粒輕輕混勻；

✦ 加入聚凝胺至終濃度為5μg-10μg/mL。輕輕混勻。以上每個(gè)成分需要按順序加入。

3）去除培養(yǎng)基，在細(xì)胞中加入DNA-培養(yǎng)基-聚凝胺溶液，在37°C孵育細(xì)胞6-20h。細(xì)胞培養(yǎng)的前6h內(nèi)約每1.5h輕柔混勻；

4）去除DNA-培養(yǎng)基-Polybrene溶液。用DMSO shocksolution（15%DMSOin1×HBSS）輕輕蓋住細(xì)胞（60mm培養(yǎng)皿3mL，100mm培養(yǎng)皿4mL）。每次加入溶液時(shí)用手輕輕搖晃培養(yǎng)盤10s，使得液體均勻分布。然后37℃孵育細(xì)胞4min；

5）立即去除DMSO shocksolution，用完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基輕輕清洗細(xì)胞2次。對(duì)于60mm培養(yǎng)皿每次用5mL培養(yǎng)液清洗，100mm培養(yǎng)皿每次用10mL培養(yǎng)液清洗；

6）加入完全培養(yǎng)基到細(xì)胞中；

7）穩(wěn)定轉(zhuǎn)化：去除生長(zhǎng)培養(yǎng)基，按照1:5的比例用選擇培養(yǎng)基裂解細(xì)胞。瞬時(shí)表達(dá)：去除生長(zhǎng)培養(yǎng)基，加入新鮮的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。24-72h后收獲細(xì)胞。

 

應(yīng)用案例

 

例1：聚凝胺用于慢病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染

 

在篩選穩(wěn)定表達(dá)ORF3a的多克隆THP-1細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)中，研究人員在收集慢病毒上清液后，加入8μg/mL Polybrene感染THp-1細(xì)胞。

 

參考文獻(xiàn)：SARS-CoV-2 ORF3a positively regulates NF-κB activity by enhancing IKKβ-NEMO interaction.Virus Research,2023.

 

例2：聚凝胺用于假病毒中和試驗(yàn)

 

在銀杏酸抑制SARS-CoV-2及其變異體的機(jī)制研究中，將受試化合物與hACE2/HEK293T細(xì)胞在37℃預(yù)孵育1h，然后在每孔中加入SARS-CoV-2假病毒和6μg/mL Polybrene孵育24 h，感染后48h計(jì)算IC50。

 

參考文獻(xiàn)：Ginkgolic acids inhibit SARS-CoV-2 and its variants by blocking the spike protein/ACE2 interplay. International Journal of Biological Macromolecules,2023.

 

例3：聚凝胺用于篩選-D-表型紅細(xì)胞

 

在初篩選實(shí)驗(yàn)中，聚凝胺按4/3梯度連續(xù)稀釋制備梯度液，以聚凝胺梯度液：IgG抗-D比例 3：2配制混合液，在96孔板中，每孔加入30μL上述混合液后，每列再依次加0~35μL LIM液（以 5μL為梯度遞增），最后加入 30μL 3%紅細(xì)胞懸液，混勻，500×g離心5min，750 rpm震蕩3min，觀察不同表型細(xì)胞結(jié)果。

 

參考文獻(xiàn)：趙俸涌,王中英,張玉宇等.應(yīng)用聚凝胺篩選-D-表型紅細(xì)胞的研究[J].中國(guó)輸血雜志, 2021.