細(xì)胞焦亡的發(fā)生原因及不同類型細(xì)胞的解決方案

 

Pyroptosis，即細(xì)胞焦亡，又稱炎癥程序性細(xì)胞死亡。小伙伴們可能要說了，“Wow~字都認(rèn)識，話是真沒聽懂”。

首先呢，它是一種細(xì)胞程序性死亡 (Programmed Cell Death, PCD)，即細(xì)胞接受某種信號或受到某些因素刺激后，為了維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，按照預(yù)定的程序發(fā)生的一種主動性消亡過程。也就是說，這是完全自愿的高尚犧牲！
程序性細(xì)胞死亡主要包括：程序性壞死（Necroptosis）、凋亡（Apoptosis)、細(xì)胞焦亡（Pyroptosis）和鐵死亡（Ferroptosis）等。感興趣的小伙伴可以參考小 M 往期的細(xì)胞死亡相關(guān)推文，此處就不再贅敘。
其次，細(xì)胞焦亡是一種炎癥形式，其由促炎信號觸發(fā)并與炎癥相關(guān)[1]，可經(jīng)微生物感染或宿主因素引發(fā)，最常在細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌或病原體感染時發(fā)生[2]。它是由炎癥小體的活化及炎癥性半胱天冬酶 (Caspases) 的激活引起的（炎癥小體往期回顧：炎癥小體：免疫炎癥領(lǐng)域熱門選手）。

細(xì)胞焦亡會發(fā)生細(xì)胞腫脹、細(xì)胞膜起泡等細(xì)胞溶解現(xiàn)象（類似壞死），涉及多種以炎癥和細(xì)胞死亡為特征的疾病，包括自身炎癥綜合征、神經(jīng)退行性疾病、炎癥性腸病和腦缺血等。

 

圖 1. 細(xì)胞焦亡與其他細(xì)胞程序性死亡的特征^[3]。 
▐  細(xì)胞焦亡過程[4]：

細(xì)胞焦亡與細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死不同，它是由炎癥小體的活化及炎癥性半胱天冬酶的激活引起的，通常與感染、疾病和免疫反應(yīng)有關(guān)。細(xì)胞焦亡的過程涉及多個環(huán)節(jié)，如病原體感染、炎性小體的形成與活化等[4]。

圖 2. 細(xì)胞焦亡概述^[5]。 
 如下所述
1. 病原體感染：病原體進(jìn)入宿主細(xì)胞，被宿主細(xì)胞的模式識別受體 (PRRs) 識別，如 Toll 樣受體 (TLRs)、NOD 樣受體 (NLRs) 和 RIG-I 樣受體 (RLRs) 等。
2. 炎癥小體形成：識別到病原體的細(xì)胞會激活炎性小體。典型的炎性小體包括 NLRP3、ASC 和 Caspase-1。激活后的 NLRP3 與 ASC 結(jié)合，繼而招募 Caspase-1，形成炎性小體。
3. Caspase 蛋白活化：炎性小體的形成將導(dǎo)致 Caspase-1 的活化�；罨�的 Caspase-1 能夠切割并激活一系列底物，如炎癥性細(xì)胞因子前體 (如 pro-IL-1β 和 pro-IL-18) 和 Gasdermin D。
4. Gasdermin D 活化：活化的 Caspase-1 切割 Gasdermin D，產(chǎn)生 N 端和 C 端兩個片段。其中活性的 N 末端片段可以穿透細(xì)胞膜，形成孔道。細(xì)胞膜孔道的形成導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)液體和離子的快速流動，使細(xì)胞發(fā)生腫脹。
5. 細(xì)胞膜破裂與炎癥：膜孔道的形成會致使細(xì)胞破裂。在這個過程中，細(xì)胞被迫吸收外界離子和水分，同時向外釋放細(xì)胞內(nèi)容物，如炎癥因子 IL-1β 和 IL-18。這些炎癥因子將進(jìn)一步引發(fā)免疫系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)。
6. 細(xì)胞碎片及清理：聚集在焦亡細(xì)胞附近的周圍的巨噬細(xì)胞會清理最后的戰(zhàn)場，清除細(xì)胞碎片，幫助減輕炎癥反應(yīng)。
 
 

細(xì)胞焦亡主要依靠炎癥小體激活 Caspase 家族蛋白引起各種生理反應(yīng)[6]。而炎癥小體通常由傳感器蛋白、銜接蛋白 (ASC)、以及無活性的 Caspase 蛋白前體組成。這種復(fù)合物觸發(fā)的焦亡可分為 Caspase-1 激活的經(jīng)典途徑或 Caspase-11/4/5 激活的非經(jīng)典途徑[7]。

 

▐  經(jīng)典焦亡：Caspsae-1^[4][8][9]：

Caspase-1 是焦亡過程中最重要的 Caspases 家族成員，通過集結(jié)響應(yīng)不同刺激的炎性傳感因子，構(gòu)建出了專屬 Caspase-1 經(jīng)典通路戰(zhàn)艦群：NLRP3 炎性體、AIM2 炎性體、NLRP1 炎性體、PYRIN 炎性體，以及 NLRC4 炎性體。

這些炎癥小體可介導(dǎo)底物 Gasdermin D (GSDMD) 或炎癥因子前體 (如 pro-IL-1β 和 pro-IL-18) 的裂解，打通膜孔道，而這類變化將導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞釋放炎癥因子，引發(fā)炎癥反應(yīng)，激發(fā)焦亡[8]。

圖 3. Caspase-1 激活的經(jīng)典途徑^[9]。

 

▐  非經(jīng)典焦亡：Caspase-11/4/5^[6][10]：

比起規(guī)模龐大，訓(xùn)練有素的 Caspase-1 戰(zhàn)隊，Caspase-11/4/5 更像伺機(jī)而動的偵察兵。它們可以直接識別病原體的脂多糖 (LPS)，從而通過非炎性小體途徑激活焦亡過程。當(dāng) Caspase-11/4/5 與 LPS 結(jié)合時，可直接切割 GSDMD，產(chǎn)生活性 N 末端片段，形成細(xì)胞膜孔道，導(dǎo)致焦亡。

圖 4. Caspase-11/4/5 激活的非經(jīng)典途徑^[9]。

 

在一些關(guān)鍵時刻，Caspase-4/11 在肺動脈高壓 (PAH) 動物模型和 TNF-α 誘導(dǎo)的人肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞中被激活�；罨�的 Caspase-4/11 還能夠剪切 Caspase-3 前體，使其活化。被激活的 Caspase-3 在隨后裂解 Gasdermin E  (GSDME)，造成細(xì)胞膜穿孔，進(jìn)一步推動焦亡。而 Caspase-5 在某些情況下可以參與炎性小體的組裝和激活，發(fā)揮類似類似 Caspase-1 的作用進(jìn)而影響焦亡途徑。

 

▐  Caspase-3 引發(fā)的細(xì)胞焦亡^[11]：

在上一個單元故事中早早露面的 Caspase-3 并不神秘。它主要與細(xì)胞凋亡過程有關(guān)，而近年來，人們發(fā)現(xiàn)了 Caspase-3 的另一個作用，它可以位于 GSDME 的上游，在焦亡中發(fā)揮炎癥切割作用[12]。

圖 5. caspase-3 細(xì)胞凋亡以及 caspase-3/GSDME 介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡途徑^[12]。

在病毒感染的背景下，Caspase-3 被激活并間接促使 GSDME 的切割。GSDME 被剪切為 N 端和 C 端兩個片段，其中 GSDME-N 端片段在細(xì)胞膜上形成孔道，導(dǎo)致離子和水分進(jìn)入細(xì)胞，使細(xì)胞膜破裂。
在一些情況下，活化的 Caspase-1 導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)線粒體損傷后，也會誘發(fā) Caspase-3 的激活，推動焦亡。

 

▐  Caspase-6/8/9與細(xì)胞焦亡：

Caspase-6、Caspase-8 和 Caspase-9 的不同調(diào)節(jié)也會影響焦亡途徑。小 M 為大家整理在下面啦~

 

圖 6. Caspase-6/8/9 對細(xì)胞焦亡的影響。

 

細(xì)胞焦亡如何檢測呢？下面小 M 以文獻(xiàn)為例為大家介紹幾種常用的細(xì)胞焦亡檢測方法~

 

近期發(fā)表的文獻(xiàn) "Mannose antagonizes GSDME-mediated pyroptosis through AMPK activated by metabolite GlcNAc-6P" 表明，CCCP (Carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazine) 加鐵可誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞中 GSDME 依賴性細(xì)胞焦亡，而甘露糖可逆轉(zhuǎn)不同癌細(xì)胞系中 GSDME 介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡[17]。

作者使用甘露糖預(yù)處理不同的癌細(xì)胞系，然后用不同的誘導(dǎo)劑處理 24 小時，檢測評估了焦亡的發(fā)生：包括特征形態(tài)、GSDME 裂解和 LDH 釋放。

 

▐  形態(tài)觀察：
實時監(jiān)測細(xì)胞狀態(tài)和細(xì)胞死亡，分辨焦亡引起的細(xì)胞形態(tài)變化，如細(xì)胞質(zhì)腫脹和膜破裂等。

圖 7. 焦亡細(xì)胞的形態(tài)變化 (紅色箭頭表示焦亡細(xì)胞)^[17]。

 

▐ Caspase、Gasdermins 蛋白的裂解^[17]：

細(xì)胞焦亡期間會發(fā)生 Gasdermins 和Caspases 蛋白的剪切，可通過免疫印跡 (Western blot) 等確定蛋白的裂解。例如，使用甘露糖預(yù)處理黑色素瘤細(xì)胞系，后用 CCCP/FeSO₄ 誘導(dǎo)焦亡，可觀察到焦亡細(xì)胞中發(fā)生 GSDME 裂解[17]。

 

圖 8. 焦亡細(xì)胞中發(fā)生 GSDME 裂解^[17]。

 
▐  LDH 釋放實驗：

當(dāng)細(xì)胞發(fā)生焦裂時，細(xì)胞膜會破裂并釋放 LDH。可以通過檢測培養(yǎng)液中 LDH 活性的變化來判斷細(xì)胞是否發(fā)生焦裂[16]。作者使用甘露糖預(yù)處理不同的黑色素瘤細(xì)胞系，后用 CCCP/FeSO₄ 誘導(dǎo)焦亡，結(jié)果表明，與對照組（Ctrl）相比，CCCP/FeSO₄ 實驗組 LDH 大量釋放[17]。

圖 9. 焦亡細(xì)胞中乳酸脫氫酶 (LDH) 的釋放^[17]。

 

▐  IL-1β 和 IL-18 釋放：

炎性程序性細(xì)胞死亡通常伴隨著炎癥因子 IL-1β 和 IL-18 的釋放�？赏ㄟ^ELISA 或其他免疫檢測方法檢測這些炎癥因子的釋放情況[17]。例如，LPS 引發(fā)的 THP-1 細(xì)胞在沒有抑制劑的情況下用 Nigericin 處理時，檢測到 Caspase-1、GSDMD 和 pro-IL-1β 裂解為對應(yīng)的活性形式。

圖 10. pro-IL-1β 的裂解和 IL-1 的釋放^[17]。

 

細(xì)胞焦亡通常伴隨著孔素的形成和細(xì)胞膜的破裂。可以使用熒光染料 (如丙啶酮、YO-PRO-1 或 PI) 標(biāo)記孔素并通過流式細(xì)胞術(shù)或熒光顯微鏡觀察細(xì)胞膜孔的形成[17][18]。

 
此外，還可通過炎性小體形成和炎性半胱天冬酶的活化來判斷：細(xì)胞焦亡的特點是炎性體的形成，其標(biāo)記物是 NLRP3。因此，可通過免疫印跡(Western blot)、流式等技術(shù)檢測炎性小體 NLRP3 的表達(dá)和 Caspase-1 的活化情況[19]。

 

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【17】Ai YL, et al. Mannose antagonizes GSDME-mediated pyroptosis through AMPK activated by metabolite GlcNAc-6P. Cell Res. 2023 Jul 17.
 
【18】Hu JJ, et al. FDA-approved disulfiram inhibits pyroptosis by blocking gasdermin D pore formation. Nat Immunol. 2020 Jul;21(7):736-745.、
 
【19】Kucia M, et al. An evidence that SARS-Cov-2/COVID-19 spike protein (SP) damages hematopoietic stem/progenitor cells in the mechanism of pyroptosis in Nlrp3 inflammasome-dependent manner. Leukemia. 2021 Oct;35(10):3026-3029.