Mirus轉(zhuǎn)染試劑TransIT-X2®應(yīng)用于多種核酸/蛋白及細胞類型研究

基于需要遞轉(zhuǎn)不同種類核酸/蛋白類型研究，在細胞轉(zhuǎn)染環(huán)節(jié)，研究者們常碰到如下三類問題：

1. 細胞對化學試劑較為敏感，轉(zhuǎn)染后，細胞活率下降或死亡；
2. 研究常用細胞類型較多，不同類型細胞，轉(zhuǎn)染效率差異較大，導致單個轉(zhuǎn)染試劑或者實驗流程，無法滿足實驗需求；
3. 遞轉(zhuǎn)多種類型核酸或蛋白，需要挑選對應(yīng)的轉(zhuǎn)染試劑，并且需要大量實驗優(yōu)化，才可以得到較高的轉(zhuǎn)染效率。

有沒有一款化學轉(zhuǎn)染試劑，可以同時應(yīng)對常規(guī)到難轉(zhuǎn)染的細胞類型，有著較低的細胞毒性，并且適用于多種核酸/蛋白類型遞轉(zhuǎn)呢？兼具多重功能、高性能的TransIT-X2®轉(zhuǎn)染試劑，可同時應(yīng)對常見細胞及難轉(zhuǎn)染細胞類型，避免條件摸索和大量的重復(fù)性實驗，輕松得到您理想的實驗結(jié)果。

• 已驗證在大多數(shù)細胞類型中（如貼壁/懸浮細胞、原代細胞、神經(jīng)細胞等），都有著優(yōu)異的轉(zhuǎn)染效率、低毒性（特別相對于形成脂質(zhì)體復(fù)合物的Lipofectamine®系列試劑）、高性能的表現(xiàn)；
• 適用于多種研究領(lǐng)域，包括但不限于干細胞研究、基因編輯CRISPR研究、RNAi基因干擾/沉默、穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株構(gòu)建、低毒性的轉(zhuǎn)染實驗、共轉(zhuǎn)染實驗等；
• 允許高效且穩(wěn)定的同時遞轉(zhuǎn)多種核酸/蛋白類型，包括但不限于質(zhì)粒 DNA、siRNA/miRNA 和 CRISPR/Cas9 組分。

為什么Mirus TransIT-X2® Dynamic Delivery System有著如此高性能及廣泛適應(yīng)性呢？這歸因于Mirus強大且高效的專利遞轉(zhuǎn)平臺設(shè)計，可進行多重、多功能組合的轉(zhuǎn)染試劑組分篩選并優(yōu)化。成立于1995年的Mirus，專注及深耕核酸遞轉(zhuǎn)領(lǐng)域多年（圖1），從最早具有低毒性的TransIT ® -LT1到GMP級別、可用于AAV和LV生產(chǎn)的TransIT-VirusGEN®，都是基于該遞轉(zhuǎn)平臺進行設(shè)計及開發(fā)的。截至目前，使用Mirus產(chǎn)品發(fā)表文章已超過1萬篇，并且發(fā)表文章及Mirus數(shù)據(jù)庫涵蓋了超過1200種細胞類型，更多文章及數(shù)據(jù)查詢，請點擊這里。
   
不同于傳統(tǒng)基于單組分的轉(zhuǎn)染試劑（如陽離子聚合物或陽離子脂質(zhì)體），為了進一步提高轉(zhuǎn)染效率，以應(yīng)對不同細胞類型或特定的應(yīng)用。Mirus將專利的多聚物(Polymer)及脂質(zhì)(Lipids)技術(shù)進行多重組合，在不形成脂質(zhì)體復(fù)合物（即liposome，通常具有細胞毒性）前提條件下，得到多種類、高性能的轉(zhuǎn)染方案，克服細胞遞轉(zhuǎn)過程中的多重阻礙，以實現(xiàn)更高效轉(zhuǎn)染和更低的細胞毒性（圖2）。
   
基于上述Mirus強大、高效的專利遞轉(zhuǎn)平臺設(shè)計，在進行多重、多組合篩選、優(yōu)化及后續(xù)驗證，獨有的智能迭代設(shè)計流程，優(yōu)化轉(zhuǎn)染技術(shù)中的每個組分（圖3）。Mirus推出一系列經(jīng)典轉(zhuǎn)染試劑，以應(yīng)對多種需求：

1. 廣譜、高性能、低毒性的轉(zhuǎn)染試劑家族: TransIT-X2^®、TransIT^®-LT1、TransIT^®-2020
2. 針對特定細胞類型的轉(zhuǎn)染試劑家族：TransIT^®-293、TransIT^®-BrCa、TransIT^®-CHO、TransIT-HeLaMONSTER^®、TransIT^®-Insect、TransIT^®-Jurkat、TransIT^®-Keratinocyte
3. 針對特定應(yīng)用的轉(zhuǎn)染試劑家族：

• 病毒生產(chǎn)：VirusGEN^® 轉(zhuǎn)染試劑及配套試劑盒、TransIT^®-Lenti
• 蛋白/抗體生產(chǎn)：TransIT-PRO^®、CHOgro^® Expression System、CHOgro^® High Yield Expression System

1. 寡核苷酸遞轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)染家族：TransIT^®-Oligo、TransIT-siQUEST^®、TransIT-TKO^®
2. mRNA及長鏈RNA遞轉(zhuǎn)：TransIT^®-mRNA

 
Mirus TransIT-X2®轉(zhuǎn)染試劑性能數(shù)據(jù)展示

Mirus TransIT-X2®Dynamic Delivery System遞轉(zhuǎn)表達EGFP質(zhì)粒DNA分別至A549、CHO-K1、Hep G2、MDCK、LNCaP、PC-12、原代人乳腺上皮細胞(HMEC)和正常人真皮成纖維細胞(NHDF)細胞中。實驗使用96孔板， TransIT-X2®試劑加入量為0.2-0.4µl，DNA加入量為0.1µg(使用試劑:DNA=2:1、3:1或4:1)。轉(zhuǎn)染后48小時，使用Guava® easyCyte™ 5HT流式細胞儀重復(fù)檢測三次，評估轉(zhuǎn)染效率。
   
使用TransIT-X2®(Mirus Bio)、Lipofectamine®2000 (Thermo Fisher Scientific)或Lipofectamine®3000 (Thermo Fisher Scientific)轉(zhuǎn)染熒光素酶編碼質(zhì)粒DNA至A549 (A)或MDCK (B)細胞中，轉(zhuǎn)染24小時，通過熒光素酶活性評估轉(zhuǎn)染效率，定量受損細胞中釋放的LDH評估細胞毒性。與Lipofectamine®2000或Lipofectamine®3000的細胞相比，在最佳試劑:DNA比例下，Trans - x2®有著更高的熒光強度及更低的細胞毒性。  
實驗Tips: 針對更多特定細胞類型，試劑使用建議，詳細請見：Cell-type specific transfection protocol recommendations (PDF).
 
Mirus TransIT-X2®在RNAi干擾實驗中性能數(shù)據(jù)展示
基因沉默相關(guān)功能研究在分子和細胞生物學中發(fā)揮著重要作用，化學轉(zhuǎn)染也在該研究領(lǐng)域扮演者重要角色。常見參與RNAi干擾途徑的天然RNA分子包括：

• 小干擾 RNA (Small interfering RNAs, siRNA) ：由雙鏈 RNA(dsRNA)斷裂所產(chǎn)生的短雙鏈 RNA(20-25bp)；
• 微小 RNA(MicroRNAs, miRNAs) ：非編碼 RNA 處理后所產(chǎn)生的一類短的、單鏈 RNA(20-22nt)。

利用 RNAi 抑制基因表達的另一種方法為短發(fā)夾 RNA(short hairpin RNA , shRNA)，這些短 RNA 序列可通過病毒或非病毒載體方式進行表達，更多詳細信息可查閱Mirus Applications | RNAi Gene Silencing。
   
TransIT-X2®Dynamic Delivery System和Lipofectamine®2000轉(zhuǎn)染試劑用于轉(zhuǎn)染siRNA(靶點為內(nèi)源性蛋白質(zhì)- GAPDH和AHA1)，對照使用正常人類真皮成纖維細胞(NHDF)遞轉(zhuǎn)非靶向siRNA。Trans IT-X2®加入量為4µl， Lipofectamine®2000加入量為6µl，siRNA加入量都為25 nM。使用qRT-PCR相對于18s rRNA水平測量GAPDH或AHA1 mRNA進行檢測，轉(zhuǎn)染后48小時均一化至非靶向?qū)φ战M的mRNA水平，誤差則為三次復(fù)孔實驗的標準差。
  圖7  基于siRNA核酸遞轉(zhuǎn)類型的基因沉默研究，相比Lipofectamine® 2000，TransIT-X2®有著更高的基因沉默效率

TransIT-X2®Dynamic Delivery System和Lipofectamine®2000轉(zhuǎn)染試劑用于轉(zhuǎn)染Pre-miR™ hsa-miR-1 miRNA Precursor 或者mirVana™ miRNA mimic, miR-1 (兩者都已驗證，可降低PTK9 mRNA表達水平)。Pre-miR™陰性質(zhì)控用于評估m(xù)RNA表達水平基線值。Trans IT-X2®及Lipofectamine®2000試劑加入量都為3µl， 加入50 nM miRNA。使用qRT-PCR相對于18s rRNA水平，經(jīng)過陰性質(zhì)控的均一化，得到PTK9 mRNA表達水平值。
  圖8  基于miRNA (miRNA Precursor及miRNA mimic)基因沉默研究，相比Lipofectamine® 2000，TransIT-X2®有著更高的基因沉默效率
 
Mirus TransIT-X2®在CRISPR基因編輯實驗中性能數(shù)據(jù)展示
經(jīng)過改造及優(yōu)化的細菌 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，已被廣泛應(yīng)用到哺乳細胞的基因編輯中�；�于CRISPR基因編輯實驗常見兩組分：Cas9蛋白及引導RNA(gRNA)。當Cas9蛋白切割了靶向基因組DNA，會觸發(fā)兩種內(nèi)源性修復(fù)機制，即非同源末端連接(NHEJ)和同源定向修復(fù)(HDR)，以應(yīng)對細胞中產(chǎn)生的DNA斷裂�；�于NHEJ細胞修復(fù)通路，為非精準、且容易出錯細胞修復(fù)通路，可引入導致基因功能缺失的Indel。基于HDR的細胞修復(fù)通路，則需要額外的同源 DNA 作為修復(fù)模板，從而實現(xiàn)“精準”修復(fù)，在目的基因插入特定的基因或長片段序列。
 
根據(jù)研究者們不同的實驗需求，CRISPR基因編輯可以有多種類型實驗設(shè)置，這意味需要面對不同核酸類型的轉(zhuǎn)染甚至共轉(zhuǎn)染，舉例如下：

1.    質(zhì)粒pDNA轉(zhuǎn)染
  作為CRIPSR實驗關(guān)鍵兩組分：Cas9蛋白及gRNA，可以設(shè)計單個質(zhì)粒DNA，共同表達兩組分(A)；或者使用兩質(zhì)粒系統(tǒng)，其中一個質(zhì)粒表達Cas9蛋白，另外一個質(zhì)粒表達gRNA(B)；當使用Cas9切口酶(Nickase)，則需要兩條gRNA，這時可能需要三質(zhì)粒系統(tǒng)的遞轉(zhuǎn)實驗。

2.    質(zhì)粒DNA及RNA寡核苷酸共轉(zhuǎn)染
  此時，與上述實驗設(shè)計不同的是，gRNA以寡核苷酸形式進行遞轉(zhuǎn)，這就意味著遞轉(zhuǎn)實驗需要同時轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA以及RNA寡核苷酸(A和B)。

3.    mRNA及RNA寡核苷酸共轉(zhuǎn)染
  為了避免由于質(zhì)粒DNA基因組整合而導致的脫靶效應(yīng)，可以共轉(zhuǎn)染編碼Cas9蛋白的mRNA及gRNA (RNA寡核苷酸)。

4.    Cas9/gRNA RNP復(fù)合物遞轉(zhuǎn)
  隨著Cas9蛋白及gRNA商品化趨于成熟，越來越多的研究者們選擇直接從第三方購買高保真Cas9蛋白，以及有著額外化學修飾且在細胞內(nèi)更穩(wěn)定的gRNA寡核苷酸。除了極大的縮短和簡化CRISPR實驗流程外，相對于質(zhì)�；蛘適RNA方式合成，直接遞轉(zhuǎn)RNP復(fù)合物的方式有著更高的特異性及編輯效率。

實驗Tips: 針對上述不同CRISPR實驗設(shè)計及遞轉(zhuǎn)情形，TransIT-X2® Dynamic Delivery System經(jīng)優(yōu)化的具體實驗說明， 下載鏈接如下：
TransIT-X2® for CRISPR Plasmid + gRNA Delivery (PDF)
TransIT-X2® for CRISPR Plasmid Delivery (PDF)
TransIT-X2® for CRISPR RNP + ssODN Delivery (PDF)
TransIT-X2® for CRISPR RNP Delivery (PDF)

使用TransIT-X2® Dynamic Delivery System  (2 µl/孔，24孔板, Mirus Bio)共轉(zhuǎn)染0.5 µg質(zhì)粒DNA(表達Cas9蛋白)及50nM 2-part gRNA (PPIB基因)至HEK293T/17, U2OS 及NHDF細胞中，轉(zhuǎn)染后48小時，T7E1驗證切割效率。
  圖9  質(zhì)粒DNA和gRNA寡核苷酸共轉(zhuǎn)染：TransIT-X2®分別在293T/17、U2OS和NHDF細胞中共轉(zhuǎn)Cas9質(zhì)粒DNA與gRNA(RNA寡核苷酸)，都有著較高的基因編輯效率(18-48%)
 
2-part gRNA (PPIB基因，IDT) 及Cas9 蛋白(PNA Bio)形成RNP復(fù)合體，分別使用TransIT-X2® Dynamic Delivery System(1 µl/孔， Mirus Bio)、Lipofectamine® CRISPRMAX™ (1.5 µl/孔， ThermoFisher) 、Lipofectamine® RNAiMAX (1.5 µl/孔, ThermoFisher) 、Lipofectamine® 3000 (1.5 µl/孔ThermoFisher) 遞轉(zhuǎn)至293T/17及U2OS細胞中。測試gRNA兩種使用量(6 nM或12 nM)，相同Cas9 蛋白加入量(6 nM)，轉(zhuǎn)染后48小時，T7E1驗證切割效率。
  圖10  Cas9/gRNA RNP復(fù)合體遞轉(zhuǎn)：相較于Lipofectamine®系列轉(zhuǎn)染試劑，TransIT-X2®有著更高的切割效率
 
Mirus TransIT-X2®產(chǎn)品優(yōu)勢
☑新型基于多組分開發(fā)的廣譜型轉(zhuǎn)染試劑(適用于多種細胞，包括難轉(zhuǎn)細胞)；
☑ 可同時轉(zhuǎn)染核酸及蛋白，包括不限于DNA，siRNA/miRNA和CRISPR/Cas9復(fù)合物；
☑不形成脂質(zhì)體復(fù)合物，降低細胞毒性；
☑ 滿足多種應(yīng)用：基因過表達、基因沉默、基因編輯、干細胞研究、穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株構(gòu)建等。
 

產(chǎn)品名稱	規(guī)格	貨號
TransIT-X2® Dynamic Delivery System	1 × 0.3 ml	MIR 6003
	1 × 0.75 ml	MIR 6004
	1 × 1.5 ml	MIR 6000
	5 × 1.5 ml	MIR 6005
	10 × 1.5 ml	MIR 6006

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  美國Mirus公司成立于1995年，是世界上很早開發(fā)高效、低毒轉(zhuǎn)染試劑的公司，同時也是目前該類試劑主要的供應(yīng)商之一。Mirus被公認為轉(zhuǎn)染試劑開發(fā)的領(lǐng)跑者，其許多杰出成果獲得世界公認與廣大用戶的好評。

北京西美杰科技有限公司是Mirus中國區(qū)代理，始終秉承著專業(yè)、嚴謹?shù)膽B(tài)度為客戶提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品與服務(wù)。北京西美杰是 Mirus代理， Mirus中國代理， Mirus北京代理， Mirus總代理， Mirus上海代理，， Mirus西北代理， Mirus西南代理， Mirus東北代理， Mirus華北代理， Mirus華南代理， Mirus華中代理，負責 Mirus在中國的相關(guān)業(yè)務(wù)。