小動(dòng)物活體成像之生物發(fā)光成像的原理和實(shí)驗(yàn)步驟

小動(dòng)物活體成像技術(shù)，是在1999年美國哈佛大學(xué)Weisslede提出的一項(xiàng)技術(shù)，該技術(shù)是指應(yīng)用影像學(xué)方法, 對(duì)活體狀態(tài)下的生物過程進(jìn)行組織、細(xì)胞和分子水平的定性和定量研究。

 

傳統(tǒng)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)需要在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)分批處死動(dòng)物以獲取實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，而小動(dòng)物活體成像技術(shù)可同時(shí)觀測(cè)多個(gè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、對(duì)同一研究個(gè)體可進(jìn)行持續(xù)、反復(fù)跟蹤成像，避免屠殺動(dòng)物而造成的組間差異，節(jié)省動(dòng)物成本，被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究領(lǐng)域。

 

其中小動(dòng)物活體光學(xué)成像是通過一定方式對(duì)小動(dòng)物進(jìn)行光學(xué)標(biāo)記，再通過成像技術(shù)及設(shè)備(如Revvity IVIS高端小動(dòng)物活體光學(xué)成像系統(tǒng))對(duì)采集光信號(hào)，主要包括生物發(fā)光（bioluminescence）與熒光（fluorescence）兩種技術(shù)。

 

PART/1  生物發(fā)光VS熒光

 

PART/2  生物發(fā)光成像原理
 

生物發(fā)光成像是指通過基因工程將熒光素酶報(bào)告基因插入細(xì)胞、細(xì)菌、病毒等基因組中，使其能夠正常表達(dá)，再將細(xì)胞、細(xì)菌或病毒轉(zhuǎn)移到動(dòng)物體內(nèi)構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，向動(dòng)物體內(nèi)注射熒光素底物，底物與熒光素酶發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生光信號(hào)，發(fā)光的強(qiáng)度與標(biāo)記細(xì)胞的數(shù)目呈線性關(guān)系，可以分析動(dòng)物體內(nèi)特定的基因表達(dá)、細(xì)胞發(fā)育和相關(guān)生物學(xué)進(jìn)程。
 

常用的熒光素酶有兩種，分別是螢火蟲熒光素酶(Luciferase) 和海腎熒光素酶(Renilla)，螢火蟲熒光素酶所用的底物是D-luciferin(逐典貨號(hào)：CY057F1000)，光波長在540-600 nm，更容易透過組織，特別適合動(dòng)物深部組織成像，大部分體內(nèi)實(shí)驗(yàn)常用其作報(bào)告基因；海腎熒光素酶的底物是coelentarizine ，光波長在460-540 nm，在體內(nèi)的代謝較快。

 

圖1.生物發(fā)光成像原理示

 

PART/3  生物發(fā)光成像實(shí)驗(yàn)步驟
 

01  標(biāo)記腫瘤細(xì)胞

構(gòu)建熒光素酶重組質(zhì)粒，細(xì)胞轉(zhuǎn)染，挑選單一抗性細(xì)胞克隆。

02  篩選陽性克隆細(xì)胞株

單一抗性克隆傳代，用Luciferase Assay System檢測(cè)熒光素酶活性(逐典貨號(hào)：CY058F1000KIT)，保留RLU值維持較高的克隆直至第30代，將篩選出高效表達(dá)、陽性率接近100%的細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng)。

03  構(gòu)建動(dòng)物模型

根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇皮下移植、原位移植、尾靜脈注射等方式接種已標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞。

04  注射底物熒光素

采用腹腔注射或尾靜脈注射熒光素底物到小鼠體內(nèi)，推薦濃度是15 mg/ml，10 g小鼠需要1.5 mg的熒光素底物，等待3min，然后給動(dòng)物進(jìn)行常規(guī)麻醉(氣麻、針麻皆可)。

尾靜脈注射：皮下移植瘤、全身性腫瘤、顱內(nèi)腫瘤模型。

腹腔注射：無特殊要求均可采用（大都采用此注射法）。

05  生物發(fā)光成像

注射熒光素底物后，約1 min擴(kuò)散到小鼠全身,10 min后強(qiáng)度達(dá)到穩(wěn)定的最高點(diǎn),在最高點(diǎn)持續(xù)約20-30 min后開始衰減，約3 h發(fā)光全部消失，建議根據(jù)動(dòng)力學(xué)曲線確定具體時(shí)間。

06  螢光素酶活性的動(dòng)力學(xué)曲線

將麻醉后的動(dòng)物放置在成像室并拍攝第一張圖像后，每5-10 min連續(xù)拍照，持續(xù)40 min，獲得模型動(dòng)物的D-螢光素鉀鹽吸收動(dòng)力學(xué)曲線。

 

PART/4  生物發(fā)光成像效果影響因素

 

1.報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄

每個(gè)細(xì)胞都應(yīng)該包含相同拷貝數(shù)的報(bào)告基因。

2.啟動(dòng)子的活性

啟動(dòng)子的活性高，則熒光素酶的表達(dá)高，啟動(dòng)子的活性低，則熒光素酶的表達(dá)低。熒光素酶表達(dá)量和發(fā)光強(qiáng)度成正比。根據(jù)此原理，用特定的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)熒光素酶，來觀察該啟動(dòng)子在活體動(dòng)物體內(nèi)的特定條件下的表達(dá)情況，并檢測(cè)影響該啟動(dòng)子表達(dá)的因素。

3.熒光素底物注射方式

熒光素底物注射的方式及其準(zhǔn)確性影響生物分布，從而影響其局部組織濃度。

4.成像時(shí)間

熒光素底物在體內(nèi)一般10 min后強(qiáng)度達(dá)到穩(wěn)定的最高點(diǎn),在最高點(diǎn)持續(xù)約20-30 min后開始衰減，約3 h發(fā)光全部消失，建議根據(jù)動(dòng)力學(xué)曲線確定具體時(shí)間。

5.小鼠的毛發(fā)

小鼠毛發(fā)對(duì)光具有吸收及散射作用，建議對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠剃毛。

 

PART/5  逐典高品質(zhì)D-熒光素鉀鹽
 

逐典D-螢光素鉀鹽，其優(yōu)點(diǎn)在于純度高（HPLC>=99%）,經(jīng)驗(yàn)證的優(yōu)異的生物發(fā)光性能，以及高溶解度。游離形式的熒光素溶解度較差，而鉀鹽形式能做到較好的水溶性，逐典開發(fā)的高純度D-熒光素鉀鹽溶解度可達(dá)40mg/ml以上。

 

產(chǎn)品賣點(diǎn)：

01 高純度（HPLC驗(yàn)證純度≥99%）

 

02 高溶解度，溶解度可達(dá)40 mg/ml

 

03 優(yōu)異的生物發(fā)光性能

底物過量條件下，熒光素酶濃度與熒光強(qiáng)度呈線性關(guān)系，與競(jìng)品P品牌產(chǎn)品相比，性能相當(dāng)

 

PART/6  客戶反饋