利用酶消化法進行原代細胞分離的步驟

一， 酶功能及適用范圍介紹

細胞作為生物的基本結構單元（病毒除外），在生命活動過程中扮演著重要角色，在生物醫(yī)藥領域經常被用于基因和藥物研究的工具。實驗使用到的細胞主要是細胞系（Cell line）和原代細胞（Primary cells），這兩種細胞各有優(yōu)缺點，例如原代細胞能夠很好地模擬生物體內的環(huán)境但是重復性差；細胞系雖然重復性好，但是不能很好地模擬生物體內的環(huán)境。因此，很多時候在實驗會需要進行原代細胞的分離，對于原代細胞的分離主要是酶消化法，參與消化的酶因組織差異而存在不同，下邊就介紹一下實驗室常用的用于分離原代細胞的酶。
 

（圖1 原代細胞與細胞系的比較）

胰蛋白酶（Tyrisin）是目前各細胞實驗使用最廣泛的細胞/組織消化試劑，工作濃度在0.25%胰酶（外加0.02%EDTA（0.53mM）），它適用于消化細胞間質較少的軟組織，如胚胎、上皮、肝、腎等組織原代細胞的分離以及實驗室的細胞傳代。它的作用機制是作用于精氨酸或賴氨酸相連接的肽腱，消除細胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細胞骨架，從而使組織分散成單個細胞而分離獲得原代細胞（Primary cells）。
 

乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid, EDTA）是，一種金屬螯合劑，用于螯合培養(yǎng)基或平衡液中的二價離子，有助于增強胰蛋白酶的水解功能；此外血清能夠降低胰酶活性，因此在終止消化的時候可以添加至少5%的血清去終止胰酶的消化。
 

二， 胰蛋白酶配制

胰蛋白酶（Tyrisin）是為一種蛋白酶，在細胞培養(yǎng)實驗和原代細胞分離過程很常見，尤其是細胞傳代或凍存消化過程最常見的酶，在此以0.25%胰酶配制舉例：

（1）稱取胰酶：電子天平稱取0.25g胰蛋白酶（Tyrisin），然后溶于100ml 無菌PBS；（2）低溫低速攪拌：在胰蛋白酶加入到PBS中后，需要低溫長時間攪拌（4℃/冰浴，過夜-12-16h）；（3）調節(jié)pH:胰酶的最佳消化pH在7.4左右，因此需要調整pH；（4）過濾分裝：一般使用0.22μm濾器進行過濾，這樣幾乎就消除了細菌，可以多過濾1-2次，尤其在大批量制備時候；（5）分裝保存：根據(jù)實驗室的使用情況進行分裝，然后凍存在-20℃，正在使用的少量胰蛋白消化液于4℃保存即可；

（備注：低速配制，高速會導致胰蛋白酶氣泡進而酶的效力大大折扣，如果要加強消化能力，可以添加終濃度為0.02% EDTA（0.53mM）主要是消除PBS中Ca2+的影響，增強酶活性。）

三，原代細胞的分離（以小鼠腎臟為例）

對于原代細胞的分離成功與否最關鍵因素有三：（1）全程無菌操作；（2）選擇合適的酶和濃度；（3）選擇合適的消化時間�，F(xiàn)在以小鼠腎臟為例，進行原代細胞分離的剖析：

（a）準備工作

對于原代細胞分離培養(yǎng)通用的準備工作主要涉及培養(yǎng)基（普通培養(yǎng)基，可以適當添加細胞因子Egf和/或bFGF）、無菌操作環(huán)境（紫外燈15-30 min）、實驗器材高壓滅菌、實驗動物。

（圖2 小鼠腎臟原代細胞分離示意圖）

（b）細胞分離步驟

（1）小鼠安樂死/犧牲：大家要慢慢養(yǎng)成尊重動物福利的習慣，不然后期各方面不好說，尤其是面向世界各地研究員；

（2）暴露小鼠腹腔：使用鑷子夾住小鼠（3周左右）腹部表面皮膚，在腹部中間橫向開口約0.5cm，然后讓皮膚直接往上扯（有點殘忍，但是顯著性減少細菌感染）；當然有可以把腹部皮膚逐步用鑷子扯開，然后露出完整腹膜（千萬別弄破）；

（3）取出腎臟器官：使用無菌剪刀將腹膜縱向剪開，然后在小鼠腰部找到腎臟組織，使用鑷子將其取出；

（4）組織殺菌：將腎臟組織轉移至約10mlPBS（含3x or 2x 青霉素-鏈霉素）中反復顛倒消毒3-5 min；

（5）組織破碎：根據(jù)組織塊的大�。ㄒ话憬ㄗh不超過1cm3）,轉移直尖底1.5ml EP管中，加入適量消化液（總體積不超ep管2/3），然后使用眼科鉗充分剪碎組織；

（6）胰酶消化：使用終濃度為1-2 mg/ml膠原酶 Ⅰ在37℃震蕩水浴搖床消化20-30min，可以在消化10min、15min、20min、25min、30min取出少量消化液查看消化液中單個細胞的情況（是否存在皺縮/組織塊），進而確定最佳消化時間。

（7）過濾：體細胞直徑一般在10-20μm之間，但組織原代酶消化時候，不能用稍大一些的濾器，而是要大得多的濾器（能過濾掉組織就行），一般選擇200-400目（數(shù)值越大，濾網直接越�。�；

（8）離心收集細胞：在1000rpm左右離心5min獲得的過濾細胞懸液，并使用4℃預冷的培養(yǎng)基/PBS洗滌細胞3-5次；

（9）細胞種植：根據(jù)細胞計算，按照不同尺寸的細胞培養(yǎng)皿種植細胞，一般在培養(yǎng)皿的80-90%融合率即可，因此此時剛分離非細胞，可能細胞的分離有利于細胞生長，但是濃度太高則會因為分離過程存在死亡細胞，會釋放大量的損傷相關分子模式（DAMP）損傷正常細胞；

（10）細胞觀察與換液：一般在種植24h左右換液并觀察細胞，在36-48h根據(jù)細胞的密度和細胞狀態(tài)兩個因素，確定繼續(xù)培養(yǎng)還是傳代或者后續(xù)實驗。