質(zhì)粒dna轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞方法介紹

質(zhì)粒dna轉(zhuǎn)染真核包主要有以下兩種方法：
1．生化方法
（1）磷酸鈣介導(dǎo)的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞
1）轉(zhuǎn)染前 24 h，通過(guò)胰酶消化收集細(xì)胞，用適當(dāng)?shù)耐耆�培養(yǎng)基以1×105至4×105細(xì)胞 /cm2的密度平鋪細(xì)胞于60 mm組織培養(yǎng)皿或12孔板上。于含 5%～7% CO2的37℃溫箱孵育20 ～24 h。轉(zhuǎn)染前1 h換液。
2） 按照下屬方法制備磷酸鈣 -DNA沉淀：于5 ml滅菌塑料管內(nèi)混合100μl 2.5 mol/L CaCl2與 25μg質(zhì)粒DNA，如有必要用0.1×TE（ pH7.6）將體積補(bǔ)至1 ml。室溫下將以上2×鈣 -DNA溶液與等體積的2×HEPES鹽溶液混合。迅速?gòu)椙迷嚬軅?cè)壁混勻溶液，靜置1 min 。
3）立即將磷酸鈣-DNA懸液轉(zhuǎn)移至上述單層細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基中。每1 ml 培養(yǎng)基加0.1 ml懸液。輕輕搖動(dòng)平皿混勻培養(yǎng)基，培養(yǎng)基會(huì)變成混濁的橘黃色。一旦形成DNA沉淀，轉(zhuǎn)染效率會(huì)大大降低，因此此步動(dòng)作應(yīng)盡可能迅速。如果是用氯喹、甘油與 /或丁酸鈉處理細(xì)胞，直接進(jìn)行步驟5。
4）如果轉(zhuǎn)染的細(xì)胞不用轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑處理，則置于含 5%~7%CO2的37℃溫箱孵育。2～ 6 h后，吸去培養(yǎng)基與DNA沉淀。加入5 ml 37 ℃預(yù)熱的完全培養(yǎng)基，將細(xì)胞放回孵箱孵育1～6天。繼續(xù)步驟 6檢測(cè)轉(zhuǎn)染DNA的瞬時(shí)表達(dá)，或者如果是穩(wěn)定轉(zhuǎn)化則直接進(jìn)行步驟7 。
5）在磷酸鈣-DNA沉淀物的存在下用氯喹處理細(xì)胞或者吸去沉淀溶液后將細(xì)胞暴露于甘油與丁酸鈉中會(huì)促進(jìn)細(xì)胞吸收 DNA。 
（2）用氯喹處理細(xì)胞
氯喹是一種弱堿，推測(cè)是通過(guò)抑制細(xì)胞內(nèi)溶酶體水解酶降解DNA 而發(fā)揮作用（Luthman and Magnusson 1983）。細(xì)胞對(duì)氯喹毒性的敏感度限制了培養(yǎng)基中加入氯喹的濃度及時(shí)間，不同細(xì)胞所需氯喹最佳濃度根據(jù)經(jīng)驗(yàn)而定。
1 ）在把磷酸鈣-DNA沉淀物加入細(xì)胞前或后按1： 1000將100 mmol/L氯喹直接加入培養(yǎng)基中。
2）細(xì)胞于含 5%~7%CO2的37℃溫箱中孵育3~5 h。
3）在用DNA于氯喹孵育細(xì)胞后，移去培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞，加 5 ml預(yù)熱的完全培養(yǎng)基。細(xì)胞于孵箱中培養(yǎng)1～6 天。繼續(xù)步驟6檢測(cè)轉(zhuǎn)染DNA的瞬時(shí)表達(dá)，或者直接進(jìn)行步驟 7以獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子。
（3）丁酸鈉處理細(xì)胞
丁酸鈉的作用機(jī)制并不確定；但它是組蛋白乙�；�形成使外來(lái)質(zhì)粒DNA趨于轉(zhuǎn)錄的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)（Workman and Kingston 1998 ）。
1）甘油休克處理后，將500 mmol/L丁酸鈉直接加入生長(zhǎng)培養(yǎng)基（甘油處理的步驟 d）。細(xì)胞類型不同，所用丁酸鈉的濃度也不同。例如：
CV-1 10 mmol/L
NIH-3T3 7 mmol/L
HeLa 5 mmol/L
CHO 2 mmol/L
其他細(xì)胞系所需濃度依經(jīng)驗(yàn)而定。
2）細(xì)胞于孵箱中培養(yǎng)1~6 天。繼續(xù)步驟6檢測(cè)轉(zhuǎn)染DNA 的瞬時(shí)表達(dá)，或者直接進(jìn)行步驟7以獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子。
6）若要檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后導(dǎo)入 DNA的瞬時(shí)表達(dá)，可在轉(zhuǎn)染后1~6天收獲細(xì)胞。雜交分析 DNA或RNA。通過(guò)體內(nèi)代謝標(biāo)記進(jìn)行放射免疫、免疫印漬、免疫沉淀或測(cè)定細(xì)胞提取物的酶活性來(lái)分析新合成蛋白。
7）分離穩(wěn)定轉(zhuǎn)染體
(1)用非選擇性培養(yǎng)基孵育細(xì)胞24~48 h ，使轉(zhuǎn)染的DNA有足夠時(shí)間表達(dá)。 
(2) 胰酶消化細(xì)胞并重鋪細(xì)胞于選擇性培養(yǎng)基中，或者直接加選擇性培養(yǎng)基/
(3)每 2~4天更換培養(yǎng)基，持續(xù)培養(yǎng)2~3周，目的是清除死細(xì)胞殘骸，促進(jìn)抗性細(xì)胞生長(zhǎng)。
(4)克隆獨(dú)立菌路、繁殖，以用于檢測(cè)（方法見(jiàn)《細(xì)胞試驗(yàn)手冊(cè)》的第 86章]）。
(6)用預(yù)冷的甲醇固定細(xì)胞15 min ，然后室溫下用10% Giemsa染色 15 min，流水沖洗，這樣可以記錄細(xì)胞克隆數(shù)目。
2．物理方法
（1）電穿孔轉(zhuǎn)染DNA
1）細(xì)胞生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)中期或晚期時(shí)收集細(xì)胞，用包有橡皮的玻璃棒或胰酶釋放貼壁細(xì)胞。 4℃、500g離心5 min（Sorvall H1000B 轉(zhuǎn)子用1 500r/min）.
2）用0.5 體積的初始培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)細(xì)胞數(shù)目。
3）離心（同步驟1）收集細(xì)胞，室溫下用培養(yǎng)基或磷酸鹽緩沖液重懸細(xì)胞至2.5×106~2.5×107 細(xì)胞/ml。
4）將400μl的各等份細(xì)胞懸液（ 106～107細(xì)胞）加入標(biāo)記好的電轉(zhuǎn)化池中，冰浴。
5）設(shè)置電轉(zhuǎn)化參數(shù)。一般電容量為1050μF 。電壓在200 V和250 V之間，不同細(xì)胞系所需電壓不同，平均為260 V 。內(nèi)部阻抗設(shè)為無(wú)窮大。進(jìn)行電穿孔前先用一個(gè)裝有PBS的電轉(zhuǎn)化池放電至少兩次。
6）每一裝有細(xì)胞的電轉(zhuǎn)化池內(nèi)加入10 ～30μg、體積最大可至40μl的質(zhì)粒DNA 。用吸管將DNA與細(xì)胞輕輕混勻。立刻繼續(xù)進(jìn)行第7步。 
7）立即將電轉(zhuǎn)化池移至電極間放電， 1～２min后，取出電轉(zhuǎn)化池，水浴，立即進(jìn)行下一步操作。
8）用帶有高壓滅菌吸頭的微量移液器將電穿孔的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至 35 mm培養(yǎng)皿中。用等體積的培養(yǎng)基洗滌電轉(zhuǎn)化池，洗液加入培養(yǎng)皿。培養(yǎng)皿置于含5%～7% CO2 的37℃孵箱。
9）重復(fù)第6 ～8步，電轉(zhuǎn)化所有DNA與細(xì)胞樣品。記錄下每一電轉(zhuǎn)化池的實(shí)際脈沖時(shí)間以便于比較。 
10）如要獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體，直接進(jìn)行第11步。如果是瞬時(shí)表達(dá)，則于電穿孔24 ～96 h后用下述方法之一檢測(cè)細(xì)胞：
*如果使用的是表達(dá)E.coli β- 半乳糖苷酶的質(zhì)粒DNA，檢測(cè)細(xì)胞裂解液中酶活性。
*如果使用綠色熒光蛋白表達(dá)載體，在450~490 nm 光照下用顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞。
*如果使用其它基因產(chǎn)物，則通過(guò)體內(nèi)代謝標(biāo)志物進(jìn)行放射免疫、免疫印漬、免疫沉淀或測(cè)定細(xì)胞提取物的酶活性來(lái)分析新合成蛋白。
11）分離穩(wěn)定轉(zhuǎn)染體：用完全培養(yǎng)基培養(yǎng) 48~72 h后，胰酶消化細(xì)胞，用適當(dāng)?shù)倪x擇性培養(yǎng)基重鋪細(xì)胞。每2~4天換液一次，持續(xù)2~3 周，目的是去除死細(xì)胞殘骸，并允許抗性細(xì)胞克隆生長(zhǎng)。