活性氧 ROS 的檢測方法及在癌癥研究中的應(yīng)用

▐  活性氧 (ROS)
【定義】: 活性氧 (Reactive oxygen species, ROS)，細(xì)胞正常代謝的副產(chǎn)物，氧的部分還原代謝產(chǎn)物，是源自 O₂ 且比 O₂ 本身更活潑的物質(zhì)的統(tǒng)稱[1][2]。
【組成】: ROS 不僅包括超氧自由基陰離子 (O₂•−) 和一些其他氧自由基，還包括一些 O₂ 的非自由基衍生物，如過氧化氫 (H₂O₂)、次氯酸 (HOCl) 和過氧亞硝酸鹽/過氧亞硝酸 (ONOO−/ONOOH)。

【來源】: ROS 主要在線粒體中產(chǎn)生，除細(xì)胞代謝外，ROS 還由特定的質(zhì)膜氧化酶在生長因子和細(xì)胞因子的作用下產(chǎn)生，同時(shí)也可通過外部因素（如環(huán)境應(yīng)激、輻射、藥物等）引起增加。

圖 1. 活性氧的潛在來源^[3]。

許多酶，包括線粒體電子傳遞鏈中的酶、黃嘌呤氧化酶、環(huán)氧化酶、脂氧化酶、髓過氧化物酶、細(xì)胞色素 P450 單加氧酶、解偶聯(lián) NOS、血紅素加氧酶、過氧化物酶和 NAD(P)H 氧化酶，都能產(chǎn)生 ROS。根據(jù)它們在細(xì)胞中的位置，這些 ROS 可以在細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞外或特定的細(xì)胞內(nèi)區(qū)室中產(chǎn)生。
▐  為什么要測活性氧 (ROS) ？
ROS 具有強(qiáng)氧化能力，低濃度時(shí)發(fā)揮復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)功能，但在高濃度時(shí)對細(xì)胞有害。

【氧化應(yīng)激】細(xì)胞具有一套防御系統(tǒng)來將 ROS 維持在生理正常水平，即酶促抗氧化劑，負(fù)責(zé)將自由基轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的、危害較小的分子。但當(dāng)細(xì)胞產(chǎn)生的 ROS 超過其抗氧化能力時(shí)，可能會(huì)對細(xì)胞大分子（如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和 DNA）造成損害，導(dǎo)致氧化應(yīng)激狀態(tài)。

這種損傷被認(rèn)為與許多疾病的發(fā)展和老化過程相關(guān)，包括肺動(dòng)脈高壓、心肌病、糖尿病、帕金森病和癌癥等。
 

舉個(gè)栗子：

氧化應(yīng)激在癌癥特征 (如血管生成、侵襲性、干細(xì)胞和轉(zhuǎn)移能力) 中起著重要作用：癌細(xì)胞是代謝活躍且缺氧的細(xì)胞，由于大量生長和血管灌注不足，往往會(huì)產(chǎn)生更多的 ROS，ROS 通過線粒體膜擴(kuò)散損傷 DNA，同時(shí)還充當(dāng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)信使，參與細(xì)胞存活、治療耐藥性等。

圖 2. 正常細(xì)胞和癌細(xì)胞中 ROS 信號(hào)傳導(dǎo)的概述^[4]。

【抗氧化劑】生物學(xué)中存在多種抗氧化劑。體內(nèi)的主要抗氧化劑是酶系統(tǒng)，例如，超氧化物歧化酶 (Superoxide dismutase, SOD) 將 O₂- 轉(zhuǎn)化為 H₂O₂、過氧化氫酶作用于 H₂O₂ 產(chǎn)生 H₂O 和 O₂、谷胱甘肽過氧化物酶分解 H₂O₂ 和 LOOH 等。此外，還有常用作“抗氧化劑”的低分子量化合物如 N-acetylcysteine (NAC)  等。

▐  活性氧 (ROS) 的檢測

目前針對 ROS 的檢測方法主要有熒光染色法、電子順磁 (自旋) 共振技術(shù)(Electron paramagnetic (spin) resonance, EPR/ESR)、化學(xué)發(fā)光法、色譜法、分光光度法、電化學(xué)生物傳感器和基于熒光蛋白等。

表 1. 檢測/定量活性氧的方法 (不同環(huán)境)^[5]。

 

▐  特定 ROS 檢測方法

• ROS：O₂•-

檢測試劑：HKSOX-1，HKSOX-1r，HKSOX-1m

超氧陰離子自由基 (O₂•-) 一直被認(rèn)為是一種重要的細(xì)胞信號(hào)分子，參與先天免疫和代謝穩(wěn)態(tài)等多種生理和病理過程。O₂•- 的異常產(chǎn)生可導(dǎo)致鐵硫 (Fe-S) 蛋白和半胱氨酸硫醇等生物分子的氧化損傷，或直接誘導(dǎo)細(xì)菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞死亡。其二次產(chǎn)物，如過氧化氫 (H₂O₂)、羥基自由基 (OH)、過氧亞硝酸鹽 (ONOO-) 和次氯酸(HOCI)，也參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和多種病理狀況。

圖 3. 使用 HKSOX-1 對受精后 72 h 斑馬魚胚胎內(nèi)源性 O₂^•−共聚焦成像^[6]。

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• ROS：H₂O₂

檢測試劑：HKPerox-1，HKPerox-2

H₂O₂ 主要由 NADPH 氧化酶與超氧化物歧化酶、線粒體電子傳遞鏈和許多其他酶共同產(chǎn)生，是一種強(qiáng)雙電子氧化劑，但其高活化能限制了其對少數(shù)生物靶標(biāo)的反應(yīng)性。H₂O₂ 相對穩(wěn)定。它與谷胱甘肽、半胱氨酸和蛋氨酸的反應(yīng)非常緩慢，但根據(jù)特定的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和環(huán)境，其對特定蛋白質(zhì)中半胱氨酸的反應(yīng)活性可大大提高到 10 M-1S-1 (約為蛋白質(zhì)中平均半胱氨酸的 106 倍)，為 H₂O₂ 在氧化還原信號(hào)中的選擇性和特異性提供了基礎(chǔ)。它們在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中起作用，特別是在免疫系統(tǒng)中，并通過鐵下垂參與細(xì)胞死亡。

圖 4. 利用 HKPerox 探針在活細(xì)胞中進(jìn)行內(nèi)源性 H₂O₂ 的分子成像^[6]。
RAW264.7 巨噬細(xì)胞與 HKPerox-1 (10 mm) 和 CCl3CN 共培養(yǎng)的代表性共聚焦圖像。

 

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• ROS：•OH

檢測試劑：HKPerox-1，HKPerox-2

在所有活性氧 ROS 中，•OH 被認(rèn)為是最具活性和最有害的一種。它的壽命很短，大約 10-9 秒，可以與許多生物分子如 DNA 堿基、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)以擴(kuò)散控制的速率發(fā)生反應(yīng)，它的過量產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷，并與多種疾病有關(guān)。另一方面，越來越多的證據(jù)表明，“•OH”和其他 ROS 的產(chǎn)生可以應(yīng)用于癌癥治療。因此，監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)•OH 對于了解其生物學(xué)影響和進(jìn)一步研究其治療用途至關(guān)重要。

圖 5. 共聚焦成像中 HKOH-1r 對 RAW264.7 小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)源性 •OH 的檢測^[8]。 

高靈敏度、高選擇性的羥基自由基檢測探針已經(jīng)被開發(fā)出來。熒光探針 HKOH-1 已被應(yīng)用于幾種羥基自由基清除劑的抗氧化能力篩選。通過共聚焦成像和流式細(xì)胞術(shù)，HKOH-1r 檢測了多種細(xì)胞類型中內(nèi)源性羥基自由基的產(chǎn)生。
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• ROS：HCLO

檢測試劑：HKOCl-3，HKOCl-4，HKOCl-4m

次氯酸和次氯酸鹽是細(xì)胞內(nèi)重要的 ROS 之一，它由 H₂O₂ 和 Cl- 通過髓過氧化物酶催化，HOCl 可以作為免疫防御系統(tǒng)破壞侵入性細(xì)菌，而另一方面，由于致病性氧化應(yīng)激損傷，它可以引起包括癌癥在內(nèi)的許多疾病。

圖 6. 內(nèi)源性 HOCl 與 HKOCl-4r 在 RAW264.7 小鼠巨噬細(xì)胞中的共聚焦熒光成像^[9]。

 

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• ROS：ONOO-

檢測試劑：HKYellow-AM (6/12-mixture)、 HKGreen-4I

氧化自由基包括活性氧 (ROS) 和活性氮 (RNS) 在腦 I/R 損傷的病理過程中起著至關(guān)重要的作用。在腦缺血再灌注階段，同時(shí)產(chǎn)生的一氧化氮 (NO) 和超氧陰離子(O₂•-) 以擴(kuò)散速率迅速形成過氧亞硝酸鹽 (ONOO-)。ONOO- 可以穿透生物膜，甚至具有比 O₂•- 更高的擴(kuò)散能力。ONOO- 通過觸發(fā)一系列分子級(jí)聯(lián)反應(yīng)，在介導(dǎo)凋亡細(xì)胞死亡、炎癥、梗死擴(kuò)大和血腦屏障破壞中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

圖 7. 內(nèi)源性 ONOO^- 與 HKYellow-AM 在 SH-SY5Y 細(xì)胞中的共聚焦熒光成像^[10]。

 

【相關(guān)產(chǎn)品】

[1] Thannickal VJ, et al. Reactive oxygen species in cell signaling. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2000 Dec;279(6):L1005-28.   
[2] Arfin S,et al. Oxidative Stress in Cancer Cell Metabolism. Antioxidants (Basel). 2021 Apr 22;10(5):642. 
[3] Griendling KK, et al. Oxidative stress and cardiovascular injury: Part I: basic mechanisms and in vivo monitoring of ROS. Circulation. 2003 Oct 21;108(16):1912-6. 
[4] Khan AQ, et al. Reactive oxygen species (ROS) in cancer pathogenesis and therapy: An update on the role of ROS in anticancer action of benzophenanthridine alkaloids. Biomed Pharmacother. 2021 Nov;143:112142. 
[5] Murphy MP, et al. Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo. Nat Metab. 2022 Jun;4(6):651-662. 
[6] Hu JJ, et al. Fluorescent Probe HKSOX-1 for Imaging and Detection of Endogenous Superoxide in Live Cells and In Vivo. J Am Chem Soc. 2015 Jun 3;137(21):6837-43.
[7] Ye S,et al. Tandem Payne/Dakin Reaction: A New Strategy for Hydrogen Peroxide Detection and Molecular Imaging. Angew Chem Int Ed Engl. 2018 Aug 6;57(32):10173-10177. 
[8] Bai X, et al. HKOH-1: A Highly Sensitive and Selective Fluorescent Probe for Detecting Endogenous Hydroxyl Radicals in Living Cells. Angew Chem Int Ed Engl. 2017 Oct 9;56(42):12873-12877. 
[9] Xiaoyu Bai, et al. HKOCl-4: a rhodol-based yellow fluorescent probe for the detection of hypochlorous acid in living cells and tissues. Organic Chemistry_Frontiers. Issue 8, 2020.
[10] Feng J,et al. Naringin Attenuates Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury Through Inhibiting Peroxynitrite-Mediated Mitophagy Activation. Mol Neurobiol. 2018 Dec;55(12):9029-9042.