基于CRISPR/Cas12a比例型生物芯片傳感器實現(xiàn)SNP相對豐度的精確定量
具有致病性線粒體DNA (mtDNA)點突變的患者通常會出現(xiàn)致殘性神經系統(tǒng)綜合征，導致嚴重殘疾和過早死亡[1]。至少有1/5000的人口受到mtDNA疾病的影響[2]。線粒體遺傳疾病的單核苷酸多態(tài)性(SNP)通常存在異質性[3]，即：野生型和突變型共存。突變異質率不同的個體表現(xiàn)出不一樣的臨床癥狀[1]。同質的mtDNA突變可以很容易地在血液中檢測到。然而，對于異質突變，突變mtDNA的百分比水平因組織而異，并且在同一個體中也可能隨時間而變化(例如，導致Leber遺傳性視神經病變(LHON)的m.11778A>G)。因此SNP異質率的精確檢測對線粒體遺傳疾病的診斷至關重要。最近，基于CRISPR的分子診斷技術因其特異性強、靈敏度高、檢測速度快等優(yōu)點受到廣泛關注[4, 5]。例如，巢式RPA和CRISPR/Cas12a輔助病毒鑒定的多重分析平臺(MAPnavi)被用于快速(< 40分鐘)診斷多種呼吸道病毒[6]。然而，這些單信號輸出方法難以準確診斷mtDNA疾病的異質性水平，因為結果受到樣本中模板總量的影響。與基因組SNP基因分型不同，mtDNA疾病的異質性水平診斷需要更準確的SNP豐度定量，這仍然是一個挑戰(zhàn)。
化學與環(huán)境工程學院劉翼振副教授團隊在生物傳感器頂級期刊《Biosensors and Bioelectronics》上發(fā)表了題為“RatioCRISPR: A Ratiometric Biochip Based on CRISPR/Cas12a for Automated and Multiplexed Detection of Heteroplasmic SNPs in Mitochondrial DNA”的研究，2022級化學專業(yè)碩士研究生吳小龍為第一作者，陳勇副研究員和劉翼振副教授為共同通訊作者，深圳大學為唯一通訊單位。
Link:https://doi.org/10.1016/j.bios.2023.115676
該研究提出了一種自動化的CRISPR/Cas12a比例型生物芯片傳感器(RatioCRISPR)，用于準確量化線粒體疾病SNP的異質性水平：首先，從mtDNA疾病患者的血液樣本中提取DNA。然后與RPA擴增試劑混合，從樣品孔中加入到芯片。之后，芯片將按照預設程序自動運行(圖1a)。而后，采用比率信號輸出的方法，提高了穩(wěn)定性，最大限度地減少了樣品濃度對異質性水平檢測的影響，使診斷結果只與模板中野生型和突變型的相對含量有關。最終RatioCRISPR實現(xiàn)了在25分鐘內同時準確地檢測8個樣品，檢出限(LOD)為15.7 aM。并成功檢測了3種mtDNA點突變(m.3460G>A、m.11778G>A和m.14484T>C)的13個模擬樣本，這些突變導致Leber遺傳性視神經病變(LHON)[8]，并設定了異質性閾值(60%)來評估疾病風險。這種自動化、精確的生物傳感器在診斷多個SNP，特別是具有異質性的SNP具有廣泛的應用，為遺傳咨詢、流行病學研究和多種異質SNP疾病提供了一個快速、經濟、實時的臨床診斷平臺。
圖1 RatioCRISPR用于mtDNA疾病診斷的示意圖
作者提出了一種通用的、自動化的RPA-CRISPR/Cas12a比率測定芯片(RatioCRISPR)，用于mtDNA疾病的診斷。作者首次嘗試在基于CRISPR/Cas的生物芯片中引入比值信號輸出方法，實現(xiàn)SNP相對豐度的精確定量。該平臺具有以下優(yōu)點:1）建立比率型信號輸出系統(tǒng)來量化異質性水平，使樣品濃度的影響減小。2）集成式封閉芯片設計，避免氣溶膠污染，實現(xiàn)多路自動化檢測。這種先進、便捷的生物傳感器具有通用性、自動化程度高、準確度高等特點，在診斷多個SNP，特別是具有異質性變異的SNP方面具有良好的實用性和市場應用前景。
RPA試劑盒及試紙條系列：
Cas酶系列
化學與環(huán)境工程學院劉翼振副教授團隊在生物傳感器頂級期刊《Biosensors and Bioelectronics》上發(fā)表了題為“RatioCRISPR: A Ratiometric Biochip Based on CRISPR/Cas12a for Automated and Multiplexed Detection of Heteroplasmic SNPs in Mitochondrial DNA”的研究，2022級化學專業(yè)碩士研究生吳小龍為第一作者，陳勇副研究員和劉翼振副教授為共同通訊作者，深圳大學為唯一通訊單位。
Link:https://doi.org/10.1016/j.bios.2023.115676
該研究提出了一種自動化的CRISPR/Cas12a比例型生物芯片傳感器(RatioCRISPR)，用于準確量化線粒體疾病SNP的異質性水平：首先，從mtDNA疾病患者的血液樣本中提取DNA。然后與RPA擴增試劑混合，從樣品孔中加入到芯片。之后，芯片將按照預設程序自動運行(圖1a)。而后，采用比率信號輸出的方法，提高了穩(wěn)定性，最大限度地減少了樣品濃度對異質性水平檢測的影響，使診斷結果只與模板中野生型和突變型的相對含量有關。最終RatioCRISPR實現(xiàn)了在25分鐘內同時準確地檢測8個樣品，檢出限(LOD)為15.7 aM。并成功檢測了3種mtDNA點突變(m.3460G>A、m.11778G>A和m.14484T>C)的13個模擬樣本，這些突變導致Leber遺傳性視神經病變(LHON)[8]，并設定了異質性閾值(60%)來評估疾病風險。這種自動化、精確的生物傳感器在診斷多個SNP，特別是具有異質性的SNP具有廣泛的應用，為遺傳咨詢、流行病學研究和多種異質SNP疾病提供了一個快速、經濟、實時的臨床診斷平臺。
圖1 RatioCRISPR用于mtDNA疾病診斷的示意圖
RPA試劑盒及試紙條系列：
| 貨號 | 產品 | 規(guī)格 |
| JY0209 | 雙靶標HybriDetect側向層析試紙條（彩虹型） | 50T |
| JY0201 | 單靶標HybriDetect側向層析試紙條（彩虹型） | 50T |
| JY0307 | Tiosbio® CRISPR單酶切及擴增產物檢測試紙條 | 50T |
| JY0301 | CRISPR Cas12/13 HybriDetect試紙條 | 50T |
| JY0308 | Tiosbio® CRISPR雙酶切檢測試紙條（變色龍） | 50T |
| WLB8201KIT | DNA恒溫快速擴增試劑盒（基礎型） | 48T |
| WLE8202KIT | DNA恒溫快速擴增試劑盒（熒光型） | 48T |
| WLN8203KIT | DNA恒溫快速擴增試劑盒（膠體金試紙條型） | 48T |
| WLRB8204KIT | RNA恒溫快速擴增試劑盒（基礎型） | 48T |
| WLRE8205KIT | RNA恒溫快速擴增試劑盒（熒光型） | 48T |
| WLRN8206KIT | RNA恒溫快速擴增試劑盒（膠體金試紙條型） | 48T |
| WLB5001 | DNA恒溫快速擴增試劑盒（液體基礎型） | 100T |
| WLN5002 | DNA恒溫快速擴增試劑盒（液體膠體金型） | 100T |
| WLR5003 | DNA恒溫快速擴增試劑盒（液體熒光型） | 100T |
| WLRB5001 | RNA恒溫快速擴增試劑盒（液體基礎型） | 100T |
| WLRN5002 | RNA恒溫快速擴增試劑盒（液體膠體金型） | 100T |
| WLRE5003 | RNA恒溫快速擴增試劑盒（液體熒光型） | 100T |
Cas酶系列
| 貨號 | 包裝規(guī)格 | 中文名稱 |
| 32108-01 | 100 pmoL | LbCas12a (Cpf1) |
| 32108-03 | 1,000 pmoL | LbCas12a (Cpf1) |
| 32117-01 | 100 pmoL | LwaCas13a (C2c2) |
| 32117-03 | 1,000 pmoL | LwaCas13a (C2c2) |
| 32118-01 | 100 pmoL | AapCas12b (C2c1) |
| 32118-03 | 1,000 pmoL | AapCas12b (C2c1) |
| 32119-01 | 100 pmoL | Un1Cas12f1 (Cas14a1) |
| 32119-03 | 1,000 pmoL | Un1Cas12f1 (Cas14a1) |
| 32104-01 | 100 pmoL | AsCas12a (Cpf1) |
| 32104-03 | 1,000 pmoL | AsCas12a (Cpf1) |
| 32116-01 | 100 pmoL | AacCas12b (C2c1) |
| 32116-03 | 1,000 pmoL | AacCas12b (C2c1) |
| 32106-01 | 100 pmoL | FnCas12a (Cpf1) |
| 32106-03 | 1,000 pmoL | FnCas12a (Cpf1) |
| 32110-01 | 100 pmoL | Lb5Cas12a (Cpf1) |
| 32110-03 | 1,000 pmoL | Lb5Cas12a (Cpf1) |
| 32101-01 | 100 pmoL | SpCas9 |
| 32101-03 | 1,000 pmoL | SpCas9 |
| 32102-01 | 100 pmoL | Sp-dCas9 |
| 32102-03 | 1,000 pmoL | Sp-dCas9 |
| 32120-01 | 100 pmoL | Sp-nCas9（H840A） |
| 32120-03 | 1,000 pmoL | Sp-nCas9（H840A） |
