多肽硫酯蛋白合成新技術(shù)
倫敦大學Macmillan研究組對采用化學配體技術(shù)合成經(jīng)修飾改變的肽和蛋白感興趣。蛋白合成和半合成——由合成和重組來源制備的多肽片段——對生產(chǎn)治療性蛋白和理解轉(zhuǎn)錄后主導修飾的機制很重要。
理解該過程很困難，因為它們不是按模板工作，也不直接受遺傳控制。Macmillan組研究采用有機合成化學、分子生物學、蛋白表達、蛋白工程來研究轉(zhuǎn)錄后的修飾改變。
尤其是，Macmillan研究組發(fā)現(xiàn)了NCL關鍵試劑多肽硫酯的新過程：多肽硫酯能從末端為Xaa-Cys序列的天然多肽中制備得到（其序列中Xaa 為Gly、His或者 Cys ）(圖1, Ref 1A)。該反應產(chǎn)生的硫酯已經(jīng)應用于合成具有生物活性的人β-defensin 3 (Ref 1B)類似物和人Hepcidin。最近已經(jīng)證實它們同O- and N- 糖肽合成 (Ref 2)和磷酸化蛋白半合成相容。
圖1 通過N→S�；D(zhuǎn)換形成硫酯。典型反應條件：10% v/v MESNa; 0.1 M Na phosphate buffer, pH 5.8; 0.5% v/v TCEP, 55°C, 48 h。(MESNa = sodium 2-mercaptoethanesulfonate，巰乙磺酸鈉, TCEP = tris-carboxyethylphosphine，tris-羧基乙膦)。
理解該過程很困難，因為它們不是按模板工作，也不直接受遺傳控制。Macmillan組研究采用有機合成化學、分子生物學、蛋白表達、蛋白工程來研究轉(zhuǎn)錄后的修飾改變。
尤其是，Macmillan研究組發(fā)現(xiàn)了NCL關鍵試劑多肽硫酯的新過程：多肽硫酯能從末端為Xaa-Cys序列的天然多肽中制備得到（其序列中Xaa 為Gly、His或者 Cys ）(圖1, Ref 1A)。該反應產(chǎn)生的硫酯已經(jīng)應用于合成具有生物活性的人β-defensin 3 (Ref 1B)類似物和人Hepcidin。最近已經(jīng)證實它們同O- and N- 糖肽合成 (Ref 2)和磷酸化蛋白半合成相容。
圖1 通過N→S�；D(zhuǎn)換形成硫酯。典型反應條件：10% v/v MESNa; 0.1 M Na phosphate buffer, pH 5.8; 0.5% v/v TCEP, 55°C, 48 h。(MESNa = sodium 2-mercaptoethanesulfonate，巰乙磺酸鈉, TCEP = tris-carboxyethylphosphine，tris-羧基乙膦)。
為了更好地理解反應， 研究發(fā)現(xiàn)增加相對少量過量的cysteine能逆轉(zhuǎn)硫酯的形成(Ref 2)，表明硫酯形成和NCL能在相同反應條件下發(fā)生。 為了使NCL反應有效率提高，需要增加高濃度半胱氨酸。 但是在分子內(nèi)NCL反應情況下(圖 2)，半胱氨酸有效濃度高時能直接形成環(huán)狀多肽產(chǎn)物(圖 2C)，而無需采用任何特異性連接劑或蛋白處理成分，例如內(nèi)含肽(Ref 3)。
圖2 從簡單的線性前體形成頭尾相接的環(huán)形肽。典型反應條件：10% v/v MESNa; 0.1 M Na phosphate buffer, pH 5.8; 0.5% v/v TCEP, 55°C, 48 h。 (注意: 環(huán)化反應中可用TCEP替代抗壞血酸鈉（sodium ascorbate）。)
圖2 從簡單的線性前體形成頭尾相接的環(huán)形肽。典型反應條件：10% v/v MESNa; 0.1 M Na phosphate buffer, pH 5.8; 0.5% v/v TCEP, 55°C, 48 h。 (注意: 環(huán)化反應中可用TCEP替代抗壞血酸鈉（sodium ascorbate）。)
Macmillan研究組發(fā)現(xiàn)當反應在pH 2時進行，產(chǎn)生的硫酯為主。但是，當pH 5-6時，無需優(yōu)化就能分離得到環(huán)形肽（產(chǎn)率為40-60%）。這是一個連續(xù)的過程，C端單一的氨基鍵選擇性地斷裂，同時新的氨基鍵在缺少酶的情況下不使用化學偶聯(lián)劑在水中形成。已發(fā)現(xiàn)，所制備的源于β-defensins的環(huán)形肽片段保留有抗微生物活性，其鏡像異構(gòu)體呈現(xiàn)出對血清中蛋白溶解的對抗性增高(圖 3)。
Macmillan研究組把連續(xù)進行的研究重點放在理解如何改進環(huán)形肽的形成。在此過程中，通過天然肽序列中N→S酰基轉(zhuǎn)移實現(xiàn)了首例無內(nèi)含肽的氨基鍵的重新排列。 此方法應該可應用于各種環(huán)形肽的形成。將來研究工作主要在制備各種天然生成的環(huán)形肽和來自生物源性的線性前體的蛋白。
圖3 短的環(huán)形肽和其鏡像異構(gòu)體可能具有抗微生物活性。注釋：D肽在血清中明顯較穩(wěn)定。
Macmillan研究組把連續(xù)進行的研究重點放在理解如何改進環(huán)形肽的形成。在此過程中，通過天然肽序列中N→S酰基轉(zhuǎn)移實現(xiàn)了首例無內(nèi)含肽的氨基鍵的重新排列。 此方法應該可應用于各種環(huán)形肽的形成。將來研究工作主要在制備各種天然生成的環(huán)形肽和來自生物源性的線性前體的蛋白。
圖3 短的環(huán)形肽和其鏡像異構(gòu)體可能具有抗微生物活性。注釋：D肽在血清中明顯較穩(wěn)定。
Derek Macmillan 博士為倫敦大學(UCL)有機化學副教授。2005年從愛丁堡大學轉(zhuǎn)到倫敦大學，成為皇家大學研究人員協(xié)會會員。此前，Macmillan博士獲得愛丁堡大學的碩士和博士學位。1999-2001年在美國加州大學Berkeley分校Carolyn Bertozzi博士實驗室從事博士后研究。在博士后研究期間，Macmillan博士開始對應用天然化學配體進行糖蛋白半合成發(fā)生興趣。Macmillan博士意識到治療性藥物需要有糖蛋白，但是僅僅通過生物合成方法不能滿足對糖蛋白的需求。因此，他的研究組致力于開發(fā)有效途徑，以可控方式把聚糖和寡糖模擬體摻入到合成的和源于細菌的多肽中。在糖蛋白方面的工作，他們繼續(xù)與DexTra Laboratories公司合作。
Macmillan研究組最近的研究方向在開發(fā)多肽和蛋白中新的N→S�；D(zhuǎn)移反應，直接利用肽的硫酯為蛋白的合成和半合成提供關鍵的工具(Ref 1-3)。
參考文獻
1. A) J. Kang, J. P. Richardson, and D. Macmillan. "3-Mercaptopropionic acid-mediated synthesis of peptide and protein
Macmillan研究組最近的研究方向在開發(fā)多肽和蛋白中新的N→S�；D(zhuǎn)移反應，直接利用肽的硫酯為蛋白的合成和半合成提供關鍵的工具(Ref 1-3)。
參考文獻
1. A) J. Kang, J. P. Richardson, and D. Macmillan. "3-Mercaptopropionic acid-mediated synthesis of peptide and protein
thioesters." Chem. Commun. (2009) 407-409.
2. B) J. Kang, N. L. Reynolds, C. Tyrrell, J. R. Dorin, and D. Macmillan. "Peptide thioester synthesis through N→S acyl-
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transfer: application to the synthesis of a β-defensin." Org. Biomol. Chem. 7 (2009) 4918-4923.
3. B. Premdjee, A. L. Adams, and D. Macmillan. "Native N-glycopeptide thioester synthesis through N→S acyl transfer."
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Bioorg. Med. Chem. Lett. 21 (2011) 4973-4975.
4. D. Macmillan, M. De Cecco, N. L. Reynolds, L. F. A. Santos, P. E. Barran, and J. R. Dorin "Synthesis of Cyclic Peptides through an Intramolecular Amide Bond Rearrangement." Chembiochem 12 (2011) 2133-2136.
4. D. Macmillan, M. De Cecco, N. L. Reynolds, L. F. A. Santos, P. E. Barran, and J. R. Dorin "Synthesis of Cyclic Peptides through an Intramolecular Amide Bond Rearrangement." Chembiochem 12 (2011) 2133-2136.
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