通過脂質體介導的CRISPR Cas13a轉染，高效檢測血漿外泌體中的miRNA

miRNA是一類由細胞的內源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，在細胞中發(fā)揮調控作用。癌細胞獨特的胞內環(huán)境可以通過miRNA等生物標志物反映在其外泌體中。癌細胞來源的外泌體miRNA在癌癥生物學中發(fā)揮著關鍵作用，可以作為癌癥診斷的潛在生物標志物。然而，外泌體中miRNA的水平非常低。因此，以一種易于操作的方式識別、檢測和量化疾病相關外泌體miRNA仍然存在挑戰(zhàn)。

在上圖中的這項最新研究中，研究團隊開發(fā)出一種新方法來檢測微量的癌癥相關的外泌體miRNA。該檢測方法基于CRISPR-Cas13a系統(tǒng)，該系統(tǒng)具有獨特的RNA酶活性，而且靈敏、可靠和有效。研究團隊先設計了一個CRISPR-Cas13a系統(tǒng)來切割熒光基團和淬滅劑標記的報告分子，然后將其包裝到脂質體中，這一脂質體相當于人造版外泌體，再使用脂質體介導的膜融合（MFS）策略，將CRISPR-Cas13a系統(tǒng)轉染到外泌體中。由于Cas13a具有獨特的RNA酶（RNase）活性，RNA引導下Cas13a的反式切割活性可以裂解熒光團和淬滅劑標記的報告細胞，導致靶標RNA觸發(fā)RNA酶激活后熒光增強。當脂質體和外泌體融合在一起時，如果外泌體中存在靶標miRNA序列，CRISPR-Cas13a就會識別并結合到靶標miRNA，然后激活反式切割活性，有效切割并產生放大的熒光信號。
 

上圖展示了乳腺癌細胞（MCF-7）來源的外泌體與健康人乳腺上皮細胞（MCF-10A）來源的外泌體以不同比例混合后，在ZetaView散射光檢測模式和熒光檢測模式下的檢測情況：

A圖：散射光模式下，盡管不同樣品的混合比例不同，但ZetaView能檢測的外泌體顆粒數(shù)量比較接近；熒光模式下，隨著含miR-21核酸的癌細胞外泌體比例降低，ZetaView檢測到的熒光顆粒明顯減少。

B圖：ZetaView散射光模式下測到的外泌體顆�？倽舛缺容^接近。

C圖：ZetaView熒光模式下測到的熒光顆粒濃度隨著癌細胞外泌體比例降低而明顯降低。

從該臨床樣本的熒光檢測結果來看，乳腺癌患者與健康捐贈者的miR-21表達差異顯著。

研究團隊表示，基于CRISPR-Cas13a的MFS-CRISPR平臺，可以直接用于檢測血液樣本，并成功區(qū)分來自乳腺癌患者和健康捐贈者的臨床樣本。因此，通過MFS-CRISPR平臺檢測分析血液樣本，有望實現(xiàn)更快、更簡便的癌癥診斷和監(jiān)測。

張俊利，師從張振中教授，于2021年12月入職于鄭州大學藥學院，直聘副研究員，主要研究方向為生物標志物分析。相關研究成果以作者或通訊作者在Journal of Extracellular Vesicles（2020，IF：25.841）、ACS Sensors（2023, IF：9.618）、Analytical Chemistry（2023, IF：8.008）、ACS Applied Materials & Interfaces（2020, IF：9.229）、Nanoscale（2022, IF：8.307）、Sensors and Actuators B:Chemical（2018, IF：6.393）和ACS Biomaterials Science & Engineering（2021, IF：5.395）等期刊上發(fā)表SCI論文7篇，授權國家發(fā)明專利1項。

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