紅綠燈信號系統(tǒng)介導的多重CRISPR診斷技術

多重核酸檢測技術是指在同一管反應中同時進行多個核酸靶標擴增與檢測的技術，該技術具有可同時檢測多個靶標、在提高檢測通量的同時簡化操作方法，且能降低檢測成本，滿足病原微生物鑒定、肉源成分溯源、轉基因成分分析等檢測需求。近年來，華中農業(yè)大學動物遺傳育種團隊圍繞CRISPR/Cas系統(tǒng)，分別開發(fā)了熒光增強型核酸可視化檢測以及直接裸眼核酸可視化檢測技術（RAVI-CRISPR）。然而，如何實現(xiàn)現(xiàn)場多重核酸可視化檢測依然是一個難題。

近日，該研究團隊在已有工作基礎上，建立了一種新的多重RAVI-CRISPR核酸熒光可視化檢測技術。該項工作主要亮點在于，研究人員針對多達28對不同熒光基團修飾的單鏈DNA熒光-淬滅報告基因（ssDNA-FQ）兩兩組合，利用Exo I核酸外切酶進行切割實驗，篩選到能用于Cas12a和Cas13a多重核酸熒光可視化檢測的最佳報告基因組合。非常有趣的是，通過比較反應溶液熒光顏色變化特征，發(fā)現(xiàn)ROX和JOE修飾的報告基因兩兩組合時，當報告基因單獨或組合存在時，被切割降解后會引起反應溶液顏色發(fā)生“紅－綠－黃”變化，類似于交通信號燈的顏色轉變，色差明顯，非常適合用于針對多重核酸靶標裸眼可視化檢測。 進一步，該研究團隊利用新開發(fā)的多重RAVI-CRISPR技術，分別建立了非洲豬瘟病毒、CD163基因敲除和乳鐵蛋白基因敲入豬多重核酸檢測方法，結果顯示，該技術可以達到10^1拷貝/微升的檢測靈敏度性，并且檢測結果與傳統(tǒng)PCR完全一致。該技術最大優(yōu)勢在于僅需小型便攜式恒溫儀和熒光檢測裝置即可開展現(xiàn)場核酸多重檢測。未來若結合微流控芯片技術，其在畜禽病原核酸現(xiàn)場可視化檢測方面將具有非常廣闊的應用前景。

該項研究成果于2023年7月11日以題為“Development of a Naked Eye CRISPR-Cas12a and Cas13a Multiplex Point-of-Care Detection of Genetically Modified Swine”發(fā)表于國際期刊ACS Synthetic Biology。華中農業(yè)大學動科動醫(yī)學院碩士研究生王緣和付蘭婷為該論文的共同第一作者，華中農業(yè)大學謝勝松教授、李長春教授、阮進學副研究員為論文共同通訊作者。該研究得到國家重點研發(fā)計劃、國家自然科學基金委創(chuàng)新研究群體基金、湖北省洪山實驗室重大項目等項目資助。