PCR反應(yīng)實(shí)驗(yàn)原理及體系解讀
PCR反應(yīng)實(shí)驗(yàn)原理：
PCR( Polymerase Chain Reaction)-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，可以選擇性擴(kuò)增一段DNA序列。其基本步驟是，首先將待擴(kuò)增的模板DNA變性使之成為單鏈，DNA樣品中，特異性的引物能夠與其互補(bǔ)的序列雜交，在dNTPs和Taq酶存在時(shí)，就可以合成模板DNA的互補(bǔ)鏈，反應(yīng)完成后，將反應(yīng)混合物加熱使DNA雙鏈變性，溫度下降后，過量的引物又可以開始第二輪的合成反應(yīng)。這種延伸-變性-退火-延伸的循環(huán)可以重復(fù)多次，使所需要的DNA片段得到特異性的擴(kuò)增。
1. 變性：加熱使模板DNA在高溫下（94℃）變性，雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈.
2. 退火：使溶液溫度降至50～60℃，模板DNA與引物按堿基配對原則互補(bǔ)結(jié)合.
3. 延伸：溶液反應(yīng)溫度升至72℃，耐熱DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，在引物的引導(dǎo)下，利用反應(yīng)混合物中的4種脫氧核苷三磷酸（dNTPs），按5ˊ→3ˊ方向復(fù)制出互補(bǔ)DNA。
上述3步為一個(gè)循環(huán)，即高溫變性、低溫退火、中溫延伸3個(gè)階段。從理論上講，每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，樣本中的DNA量應(yīng)該增加一倍，新形成的鏈又可成為新一輪循環(huán)的模板，經(jīng)過25～30個(gè)循環(huán)后DNA可擴(kuò)增106～109倍。
PCR反應(yīng)體系：
PCR 反應(yīng)體系由反應(yīng)緩沖液（10×PCR Buffer）、脫氧核苷三磷酸底物（dNTPmix）、
耐熱 DNA 聚合酶（Taq 酶）、寡聚核苷酸引物（Primer1，Primer2）、靶序列（DNA 模板）
五部分組成。各個(gè)組份都能影響 PCR 結(jié)果的好壞。
1．反應(yīng)緩沖液：
一般隨 Taq DNA 聚合酶供應(yīng)。標(biāo)準(zhǔn)緩沖液含：50mM KCl，10mM Tris-HCl
（pH8.3 室溫），1.5mM MgCl2。Mg2+的濃度對反應(yīng)的特異性及產(chǎn)量有著顯著影響。濃
度過高，使反應(yīng)特異性降低；濃度過低，使產(chǎn)物減少。在各種單核苷酸濃度為 200μM 時(shí)，
Mg2+為 1.5mM 較合適。若樣品中含 EDTA 或其它螯合物，可適當(dāng)增加 Mg2+的濃度。在
高濃度 DNA 及 dNTP 條件下進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，也必須相應(yīng)調(diào)節(jié) Mg2+的濃度。一般
以 1.5-2mM（終濃度）較好。
2． dNTP ：
高濃度 dNTP 易產(chǎn)生錯(cuò)誤摻入，過高則可能不擴(kuò)增；但濃度過低，將降低反
應(yīng)產(chǎn)物的產(chǎn)量。PCR 中常用終濃度為 50-400μM 的 dNTP。四種脫氧三磷酸核苷酸的濃度
應(yīng)相同，如果其中任何一種的濃度明顯不同于其它幾種時(shí)（偏高或偏低），就會(huì)誘發(fā)聚合酶
的錯(cuò)誤摻入作用，降低合成速度，過早終止延伸反應(yīng)。此外，dNTP 能與 Mg2+結(jié)合，使
游離的 Mg2+濃度降低。因此，dNTP 的濃度直接影響到反應(yīng)中起重要作用的 Mg2+濃度。
3． Taq DNA 聚合酶酶：
在 100μl 反應(yīng)體系中，一般加入 2-4U 的酶量，足以達(dá)到每 min
延伸 1000-4000 個(gè)核苷酸的摻入速度。酶量過多將導(dǎo)致產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。但是，不同的
公司或不同批次的產(chǎn)品常有很大的差異，由于酶的濃度對 PCR 反應(yīng)影響極大，因此應(yīng)當(dāng)作
預(yù)試驗(yàn)或使用廠家推薦的濃度。當(dāng)降低反應(yīng)體積時(shí)（如 20μl 或 50μl），一般酶的用量仍不
小于 2U，否則反應(yīng)效率將降低。
4． 引物：
引物是決定 PCR 結(jié)果的關(guān)鍵，引物設(shè)計(jì)在 PCR 反應(yīng)中極為重要。要保證 PCR
反應(yīng)能準(zhǔn)確、特異、有效地對模板 DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，通常引物設(shè)計(jì)要遵循以下幾條原則：⑴ 引物的長度以 15-30bp 為宜，一般（G+C）的含量在 45-55%，Tm 值高于 55℃
［Tm=4(G+C)+2(A+T)］。應(yīng)盡量避免數(shù)個(gè)嘌呤或嘧啶的連續(xù)排列，堿基的分布應(yīng)表現(xiàn)出
是隨機(jī)的。
⑵ 引物的 3’端不應(yīng)與引物內(nèi)部有互補(bǔ)，避免引物內(nèi)部形成二級結(jié)構(gòu)，兩個(gè)引物在 3’端
不應(yīng)出現(xiàn)同源性，以免形成引物二聚體。3’端末位堿基在很大程度上影響著 Taq 酶的延伸
效率。兩條引物間配對堿基數(shù)少于 5 個(gè)，引物自身配對若形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，莖的堿基對數(shù)不
能超過 3 個(gè)由于影響引物設(shè)計(jì)的因素比較多，現(xiàn)常常利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)。
⑶ 人工合成的寡聚核苷酸引物需經(jīng) PAGE 或離子交換 HPLC 進(jìn)行純化。
⑷ 引物濃度不宜偏高，濃度過高有兩個(gè)弊端：一是容易形成引物二聚體（primer-dimer），
二是當(dāng)擴(kuò)增微量靶序列并且起始材料又比較粗時(shí)，容易產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。一般說來，用低
濃度引物不僅經(jīng)濟(jì)，而且反應(yīng)特異性也較好。一般用 0.25-0.5pM/μl 較好。
⑸ 引物一般用 TE 配制成較高濃度的母液（約 100μM），保存于-20℃。使用前取出其中
一部分用 ddH2O 配制成 10μM 或 20μM 的工作液。
5、模板：
PCR 對模板的要求不高，單、雙鏈 DNA 均可作為 PCR 的樣品。雖然 PCR 可以
用極微量的樣品（甚至是來自單一細(xì)胞的 DNA）作為摸板，但為了保證反應(yīng)的特異性，一
般還宜用μg 水平的基因組 DNA 或 104 拷貝的待擴(kuò)增片段作為起始材料。原材料可以是粗
制品，某些材料甚至僅需用溶劑一步提取之后即可用于擴(kuò)增，但混有任何蛋白酶、核酸酶、
Taq DNA 聚合酶抑制劑以及能結(jié)合 DNA 的蛋白，將可能干擾 PCR 反應(yīng)。
PCR( Polymerase Chain Reaction)-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，可以選擇性擴(kuò)增一段DNA序列。其基本步驟是，首先將待擴(kuò)增的模板DNA變性使之成為單鏈，DNA樣品中，特異性的引物能夠與其互補(bǔ)的序列雜交，在dNTPs和Taq酶存在時(shí)，就可以合成模板DNA的互補(bǔ)鏈，反應(yīng)完成后，將反應(yīng)混合物加熱使DNA雙鏈變性，溫度下降后，過量的引物又可以開始第二輪的合成反應(yīng)。這種延伸-變性-退火-延伸的循環(huán)可以重復(fù)多次，使所需要的DNA片段得到特異性的擴(kuò)增。
1. 變性：加熱使模板DNA在高溫下（94℃）變性，雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈.
2. 退火：使溶液溫度降至50～60℃，模板DNA與引物按堿基配對原則互補(bǔ)結(jié)合.
3. 延伸：溶液反應(yīng)溫度升至72℃，耐熱DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，在引物的引導(dǎo)下，利用反應(yīng)混合物中的4種脫氧核苷三磷酸（dNTPs），按5ˊ→3ˊ方向復(fù)制出互補(bǔ)DNA。
上述3步為一個(gè)循環(huán)，即高溫變性、低溫退火、中溫延伸3個(gè)階段。從理論上講，每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，樣本中的DNA量應(yīng)該增加一倍，新形成的鏈又可成為新一輪循環(huán)的模板，經(jīng)過25～30個(gè)循環(huán)后DNA可擴(kuò)增106～109倍。
PCR反應(yīng)體系：
PCR 反應(yīng)體系由反應(yīng)緩沖液（10×PCR Buffer）、脫氧核苷三磷酸底物（dNTPmix）、
耐熱 DNA 聚合酶（Taq 酶）、寡聚核苷酸引物（Primer1，Primer2）、靶序列（DNA 模板）
五部分組成。各個(gè)組份都能影響 PCR 結(jié)果的好壞。
1．反應(yīng)緩沖液：
一般隨 Taq DNA 聚合酶供應(yīng)。標(biāo)準(zhǔn)緩沖液含：50mM KCl，10mM Tris-HCl
（pH8.3 室溫），1.5mM MgCl2。Mg2+的濃度對反應(yīng)的特異性及產(chǎn)量有著顯著影響。濃
度過高，使反應(yīng)特異性降低；濃度過低，使產(chǎn)物減少。在各種單核苷酸濃度為 200μM 時(shí)，
Mg2+為 1.5mM 較合適。若樣品中含 EDTA 或其它螯合物，可適當(dāng)增加 Mg2+的濃度。在
高濃度 DNA 及 dNTP 條件下進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，也必須相應(yīng)調(diào)節(jié) Mg2+的濃度。一般
以 1.5-2mM（終濃度）較好。
2． dNTP ：
高濃度 dNTP 易產(chǎn)生錯(cuò)誤摻入，過高則可能不擴(kuò)增；但濃度過低，將降低反
應(yīng)產(chǎn)物的產(chǎn)量。PCR 中常用終濃度為 50-400μM 的 dNTP。四種脫氧三磷酸核苷酸的濃度
應(yīng)相同，如果其中任何一種的濃度明顯不同于其它幾種時(shí)（偏高或偏低），就會(huì)誘發(fā)聚合酶
的錯(cuò)誤摻入作用，降低合成速度，過早終止延伸反應(yīng)。此外，dNTP 能與 Mg2+結(jié)合，使
游離的 Mg2+濃度降低。因此，dNTP 的濃度直接影響到反應(yīng)中起重要作用的 Mg2+濃度。
3． Taq DNA 聚合酶酶：
在 100μl 反應(yīng)體系中，一般加入 2-4U 的酶量，足以達(dá)到每 min
延伸 1000-4000 個(gè)核苷酸的摻入速度。酶量過多將導(dǎo)致產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。但是，不同的
公司或不同批次的產(chǎn)品常有很大的差異，由于酶的濃度對 PCR 反應(yīng)影響極大，因此應(yīng)當(dāng)作
預(yù)試驗(yàn)或使用廠家推薦的濃度。當(dāng)降低反應(yīng)體積時(shí)（如 20μl 或 50μl），一般酶的用量仍不
小于 2U，否則反應(yīng)效率將降低。
4． 引物：
引物是決定 PCR 結(jié)果的關(guān)鍵，引物設(shè)計(jì)在 PCR 反應(yīng)中極為重要。要保證 PCR
反應(yīng)能準(zhǔn)確、特異、有效地對模板 DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，通常引物設(shè)計(jì)要遵循以下幾條原則：⑴ 引物的長度以 15-30bp 為宜，一般（G+C）的含量在 45-55%，Tm 值高于 55℃
［Tm=4(G+C)+2(A+T)］。應(yīng)盡量避免數(shù)個(gè)嘌呤或嘧啶的連續(xù)排列，堿基的分布應(yīng)表現(xiàn)出
是隨機(jī)的。
⑵ 引物的 3’端不應(yīng)與引物內(nèi)部有互補(bǔ)，避免引物內(nèi)部形成二級結(jié)構(gòu)，兩個(gè)引物在 3’端
不應(yīng)出現(xiàn)同源性，以免形成引物二聚體。3’端末位堿基在很大程度上影響著 Taq 酶的延伸
效率。兩條引物間配對堿基數(shù)少于 5 個(gè)，引物自身配對若形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，莖的堿基對數(shù)不
能超過 3 個(gè)由于影響引物設(shè)計(jì)的因素比較多，現(xiàn)常常利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)。
⑶ 人工合成的寡聚核苷酸引物需經(jīng) PAGE 或離子交換 HPLC 進(jìn)行純化。
⑷ 引物濃度不宜偏高，濃度過高有兩個(gè)弊端：一是容易形成引物二聚體（primer-dimer），
二是當(dāng)擴(kuò)增微量靶序列并且起始材料又比較粗時(shí)，容易產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。一般說來，用低
濃度引物不僅經(jīng)濟(jì)，而且反應(yīng)特異性也較好。一般用 0.25-0.5pM/μl 較好。
⑸ 引物一般用 TE 配制成較高濃度的母液（約 100μM），保存于-20℃。使用前取出其中
一部分用 ddH2O 配制成 10μM 或 20μM 的工作液。
5、模板：
PCR 對模板的要求不高，單、雙鏈 DNA 均可作為 PCR 的樣品。雖然 PCR 可以
用極微量的樣品（甚至是來自單一細(xì)胞的 DNA）作為摸板，但為了保證反應(yīng)的特異性，一
般還宜用μg 水平的基因組 DNA 或 104 拷貝的待擴(kuò)增片段作為起始材料。原材料可以是粗
制品，某些材料甚至僅需用溶劑一步提取之后即可用于擴(kuò)增，但混有任何蛋白酶、核酸酶、
Taq DNA 聚合酶抑制劑以及能結(jié)合 DNA 的蛋白，將可能干擾 PCR 反應(yīng)。
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