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多巴胺ELISA試劑盒使用說(shuō)明

瀏覽次數(shù):2194 發(fā)布日期:2011-9-7  來(lái)源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責(zé)任自負(fù)
多巴胺ELISA試劑盒使用說(shuō)明
(德國(guó)IBL:RE59161)
1、 應(yīng)用范圍
此試劑盒可用于人血漿和尿液中多巴胺的體外定量檢測(cè),可手動(dòng)操作,也可自動(dòng)操作。進(jìn)一步的研究表明:此試劑盒還可用于組織勻漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清液的研究。
2、前言說(shuō)明
兒茶酚氨類激素腎上腺素、去甲腎上腺素和多巴胺主要由腎上腺髓質(zhì)、交感神經(jīng)系統(tǒng)和大腦產(chǎn)生。它們幾乎影響所有的組織,并與其它激素和神經(jīng)系統(tǒng)一起參與各種生理過(guò)程的調(diào)節(jié)。在許多疾病中,兒茶酚氨激素及其代謝產(chǎn)物間甲腎上腺素和去甲變腎上腺素的分泌量都會(huì)增加,因而這些激素可用于疾病的診斷。所以,這些激素的檢測(cè)對(duì)于疾病的診斷及神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤疾病的具有重要意義。它主要用于嗜鉻細(xì)胞瘤的診斷,當(dāng)然也用于成神經(jīng)細(xì)胞瘤和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞瘤的診斷。因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)一開(kāi)始時(shí)有提取步驟,所以用戶可使用各種各樣的動(dòng)物材料進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。如果用此試劑盒測(cè)大鼠、小鼠或其它動(dòng)物,則兒茶酚氨的化學(xué)結(jié)構(gòu)與動(dòng)物的相同。
3、實(shí)驗(yàn)原理
此固相酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)利用的是ELISA的夾心法。微孔中包被了羊抗兔抗體。在溫育時(shí)間之內(nèi),加入的溶液抗在體可直接與抗原分子上的一個(gè)表位結(jié)合。樣品中的抗原與酶標(biāo)二抗(可與抗原分子上的不同表位結(jié)合)在包被孔中溫育。加入底物液后,溶液所顯示的顏色強(qiáng)度與樣品中抗原的量成正比。樣品的結(jié)果可直接用標(biāo)準(zhǔn)曲線確定。
4、貯存與穩(wěn)定性
試劑盒和運(yùn)輸環(huán)境和儲(chǔ)存環(huán)境溫度為2-8℃,避免熱源或太陽(yáng)直射。樣品的儲(chǔ)存與穩(wěn)定性及試劑的準(zhǔn)備將在相關(guān)章節(jié)中闡述。開(kāi)封的試劑盒在有效期內(nèi)穩(wěn)定,前提是要將試劑盒用袋子密封并儲(chǔ)存于2-8℃的環(huán)境下。
5、樣品的采集與儲(chǔ)存
 
注意
人體內(nèi)的兒茶酚氨和間甲腎上腺素的釋放會(huì)受到一些食品和藥物的影響。因此在樣品采集前72小時(shí)內(nèi)病人應(yīng)禁止服用下列食物和藥品:維生素B,咖啡,香蕉,α甲基多巴,MAO,COMT抑制劑,還有降血壓類藥物。
 
血漿(EDTA)
注意
血液采集后兩小時(shí)內(nèi),將血液樣品冷藏于2-8℃的環(huán)境下直致離心獲取血漿。
注意靜脈穿刺采集全血的常規(guī)注意事項(xiàng)。從采集到血液樣品的那一刻起到檢測(cè)時(shí)都應(yīng)保持血液樣品的化學(xué)整體性。不要使用明顯溶血、黃疸血和脂血樣品。如果樣品出現(xiàn)混濁,則在實(shí)驗(yàn)前應(yīng)當(dāng)離心以除去所有的微粒物質(zhì)。
貯存
2-8℃
≤-20℃
避免熱源或太陽(yáng)直射,避免反復(fù)凍融,冷凍狀態(tài)下運(yùn)輸樣品。
穩(wěn)定性
6h
1個(gè)月
尿液
可以是自然尿液也可使用24h尿液。收集病人24h內(nèi)的所有尿液,之后將其加入到10-15ml 6N的HCl防腐劑中。
貯存
≤-20℃
避免熱源或太陽(yáng)直射,避免反復(fù)凍融,冷凍狀態(tài)下運(yùn)輸樣品。
穩(wěn)定性
6個(gè)月
6、試劑盒成分
注意
試劑盒所提供的試劑足夠做96孔單孔檢測(cè)或48孔雙份檢測(cè)。
 
注意
此包被板也可用于檢測(cè)腎上腺素、去甲腎上腺素和多巴胺。
 
數(shù)量
標(biāo)志
成分
1×12×8

MTP

包被板,可拆,微孔中包被了抗兔IgG(羊,單克。
1×6×2.5ml
CAL A-F
標(biāo)準(zhǔn)品A-F
腎上腺素:0;1.5;15;50;150ng/ml(0;8;27;82;273;819nmol/L)
去甲腎上素:0;5.0;15;50;150;500ng/mL(0;30;89;296;887;2955nmol/L)
多巴胺:0;12;35;115;450;2250ng/mL(0;78;228;750;2938;14688nmol/L)
即用,內(nèi)含:腎上腺素-去甲腎上腺素-多巴胺(具有生物活性),0.1M的HCl
1×2×2.5ml
CONTROL 1+2
質(zhì)控品1+2
即用,含: 腎上腺素-去甲腎上腺素-多巴胺(具有生物活性),0.1M的HCl,具體濃度及可允許范圍請(qǐng)見(jiàn)試劑瓶標(biāo)簽.
1×250μL
ENZCONJ CONC
酶聯(lián)物 濃縮型(100×)
內(nèi)含:堿性磷酸酶標(biāo)記的抗體,Tris緩沖液,HCl,0.01%的NaN3
EXTRPLATE
提取板(微孔板)
每板24孔,包被了硼酸親和凝膠。
2×60ml
EXTRBUF
提取緩沖液
粉紅色,即用,內(nèi)含:0.016%的NaN3
1×1.25ml
COMT LYO
COMT凍干粉
內(nèi)含:兒茶酚-氧位-甲基轉(zhuǎn)移酶(豬肝),NaN3
1×2ml
COMT ADD
COMT添加劑
內(nèi)含:人血漿,穩(wěn)定劑,0.01%硫柳汞。
1×7ml
ANTISERUM DO
多巴胺抗血清
紫羅蘭色,即用,內(nèi)含:抗多巴胺抗體(兔),緩沖液,穩(wěn)定劑。
2×1.25ml
COENZ
酶聯(lián)復(fù)合物
即用,內(nèi)含:S-腺苷-L-蛋白酸,穩(wěn)定劑。
1×3ml
ENZBUF
酶緩沖液
即用,內(nèi)含:Tris緩沖液,HCl,穩(wěn)定劑。
4×13ml
RELEASEBUF
Release緩沖液
黃色,即用,內(nèi)含:0.1M的HCl,指示劑。
2×3ml
ACYLREAG
;噭
即用,內(nèi)含:二甲基甲酰胺,乙醇。注意:有毒,高可燃性。
2×50ml
WASHBUR CONC
洗滌液 濃縮型(10×)
內(nèi)含:Tris緩沖液,HCl,吐溫,0.2%的NaN3
1×9×
PNPP SUBS
PNPP底物片
內(nèi)含:對(duì)硝基苯磷酸(PNPP)
1×27ml
PNPP BUF
PNPP底物緩沖液
即用,內(nèi)含:二乙醇胺,水,0.05%的NaN3
1×15ml
PNPP STOP
PNPP終止液
即用,內(nèi)含:1M的NaOH,0.25M的EDTA
1×20ml
HCl
HCl
即用,內(nèi)含:0.1M的HCl
FOIL
粘性金屬板
7、實(shí)驗(yàn)所需器材(但試劑盒不提供)
1)移液器(10;10-100;100-1000μL)
2)軌道搖床(200-900rpm)
3)旋渦混合器
4)帶儲(chǔ)器的8通道移液器
5)洗滌瓶,自動(dòng)或半自動(dòng)包被板清洗系統(tǒng)
6)酶標(biāo)儀
7)雙蒸水或去離子水
8)吸水紙,取樣吸頭,計(jì)時(shí)器
9)樣品稀釋用試管。
8、手動(dòng)操作
8.1實(shí)驗(yàn)前說(shuō)明
注意
用于96人份檢測(cè)色試劑盒成分可分成兩次進(jìn)行。下列所述體積為做48人份時(shí)所需要的量。
注意
試劑盒中的質(zhì)控品和所有尿液樣品在使用前都必須在試管中用0.1M的HCl按1:5的比例進(jìn)行稀釋(例如:20μL尿液+80μL 0.1M的HCl)。標(biāo)準(zhǔn)品無(wú)需稀釋。
8.2樣品的稀釋
如果樣品中多巴胺濃度高于最高標(biāo)準(zhǔn)品的應(yīng)按照下列所述進(jìn)行稀釋:
樣品
待稀釋
稀釋液
備注
血漿
多巴胺濃度高于最高標(biāo)準(zhǔn)品中多巴胺的濃度
雙蒸水
提取步驟前
尿液
多巴胺濃度高于最高標(biāo)準(zhǔn)品中多巴胺的濃度
0.1N的HCl
提取步驟前
8.3樣品、標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品的提取(提取板)
1)
將標(biāo)準(zhǔn)品、已稀釋好的質(zhì)控品、已稀釋好的尿液樣品各20μL和500μL血漿樣品加入到提取板相應(yīng)的微孔中。除血漿樣品孔外,在所有的微孔中加入500μL雙蒸水以消除體積差別。
2)
在每一微孔中加入1000μL提取緩沖液
3)
蓋板。在軌道搖床(600-900rpm)上18-25℃的環(huán)境下提取30min。在提取過(guò)程中,液體的表面應(yīng)該會(huì)浸濕粘性金屬板,但液體的量不能超過(guò)微孔的2/3。液體是否濺出并不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
4)
移去粘性金屬板,快速棄取孔內(nèi)反應(yīng)液,在吸水紙上拍干。
5)
每孔加入2ml雙蒸水
6)
用新的粘性金屬板蓋板。在軌道搖床上(600-900rpm)18-25℃的環(huán)境下振蕩5min。液體是否濺出并不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
7)
移去粘性金屬板,快速棄取孔內(nèi)反應(yīng)液,在吸水紙上拍干。
8)
每孔加入150μL提取緩沖液,再向每孔中加入50μL;噭,立即混合均勻。
9)
在軌道搖床(400-600rpm)上18-25℃的環(huán)境下提取20min。(無(wú)需蓋板)
10)
快速棄取孔內(nèi)反應(yīng)液,在吸水紙上拍干。
11)
每孔加入2ml雙蒸水。
12)
用新的粘性金屬板蓋板。在軌道搖床上(600-900rpm)18-25℃的環(huán)境下振蕩5min。液體是否濺出并不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
13)
移去粘性金屬板,快速棄取孔內(nèi)反應(yīng)液,在吸水紙上拍干。
14)
每孔加入300μL Release緩沖液。
15)
在軌道搖床(400-500rpm)上18-25℃的環(huán)境下振蕩30min。(無(wú)需蓋板)
已準(zhǔn)備好的樣品應(yīng)當(dāng)在當(dāng)天就進(jìn)行檢測(cè)。如果不行的話,您可將提取板用粘性金屬板蓋好,在2-8℃的環(huán)境下可存放一夜。
8.4凍干粉或濃縮成分的準(zhǔn)備
稀釋
成分
 
稀釋液
比例
備注
貯存
穩(wěn)定性
25ml
洗滌液
225ml
雙蒸水
1:10
充分混合
2-8℃
4W
60μL
酶聯(lián)物
6ml
洗滌緩沖液(已稀釋好)
1:101
臨時(shí)配置,僅能使用一次,混合時(shí)避免氣泡產(chǎn)生
18-25℃
5h
4
PNPP底物片
10.7ml
PNPP底物液
 
臨時(shí)配置,僅能使用一次
18-25℃
5h
 
9、實(shí)驗(yàn)步驟(手動(dòng)操作)
9.1 COMT酶溶液的準(zhǔn)備
注意:COMT酶溶液應(yīng)在使用前直接臨時(shí)配置
在COMT凍干粉中加入1.25ml雙蒸水,充分混和。再加入1.25ml酶聯(lián)溶液,然后再加入1.25ml酶溶液和0.40ml COMT添加劑以充分混合溶解的COMT試劑*,COMT酶溶液最后的體積為每支4.15ml。一支可做48人份。溶液可用旋渦混合器混合,但要避免氣泡產(chǎn)生,配置好的COMT溶液可在室溫下穩(wěn)定存放1小時(shí)。
*如果只需要一定量的COMT溶液,則剩余的COMT溶液應(yīng)立即凍存于-20℃的環(huán)境下。COMT溶液可在此環(huán)境下穩(wěn)定存放1-2個(gè)月。
9.2樣品、標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品的酶化
注意
如果使用自動(dòng)置換型移液器,請(qǐng)將取樣吸頭內(nèi)的殘余液體加回到提取板相應(yīng)的微孔內(nèi)。將提取板置于一斜坡位置比較適當(dāng)。
科研用組織勻漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清可按如下建議處理:細(xì)胞培養(yǎng)上清必須根據(jù)其培養(yǎng)基及其相應(yīng)濃度進(jìn)行處理:根據(jù)尿液樣品的操作說(shuō)明(至少提取20ul上清液),未稀釋樣品的靈敏度大概為1.0ng/ml。如果基質(zhì)內(nèi)添加了血清(FCS),血漿(至少提取500ul上清)操作的靈敏度可以是5pg/ml。無(wú)高氯酸的組織勻漿可用做勻漿樣品,具體信息請(qǐng)咨詢IBL漢堡公司。
9.3檢測(cè)尿液和血漿中的多巴氨
1
在包被板的每一微孔中加入75μL剛配置好的COMT酶溶液,輕輕振蕩。
2
在尿液樣品、標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品的微孔中加入90μL Release緩沖液(血漿樣品孔除外)。將已提取好的標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和尿液樣品分別10μL加入到相應(yīng)的微孔中。將100ul提取好的血漿樣品加入到相應(yīng)的微孔中。在此加樣步驟中,可直接將取樣吸頭伸入到COMT溶液中。溶液顏色變成粉色,輕輕振蕩。
3
在每一微孔中加入50ul多巴胺抗血清(紫色)。
4
蓋板,在振蕩器(400-600rpm)上室溫(18-25℃)溫育120min
5
移去粘性金屬板,棄取孔內(nèi)反應(yīng)液,每孔用250-300μL已稀釋好的洗滌液洗板6次。吸水紙上拍干以除去殘余液體。
6
在每一微孔中加入100ul臨時(shí)配置好的酶聯(lián)物。
7
蓋板,在振蕩器(400-600rpm)上室溫(18-25℃)溫育60min
8
移去粘性金屬板,棄取孔內(nèi)反應(yīng)液,每孔用250-300μL已稀釋好的洗滌液洗板6次。吸水紙上拍干以除去殘余液體。
9
如果可以的話,使用8道移液器加底物液和終止液。加底物液和終止液的時(shí)間間隔應(yīng)當(dāng)相同,使用自動(dòng)置換型移液器并避免氣泡產(chǎn)生。
10
在每一微孔中加入200ul底物液。
11
在振蕩器(400-600rpm)上室溫(18-25℃)溫育40min
12
在每一微孔中加入50ul PNPP終止液,輕輕振板以使溶液混合均勻。
13
加終止液后60min內(nèi)405nm處讀取OD值。(參考波長(zhǎng):620-650nm)
10、自動(dòng)操作步驟
10.1實(shí)驗(yàn)前說(shuō)明
注意
用于96人份檢測(cè)色試劑盒成分可分成兩次進(jìn)行。下列所述體積為做48人份時(shí)所需要的量。
注意
試劑盒中的質(zhì)控品和所有尿液樣品在使用前都必須在試管中用0.1M的HCl按1:5的比例進(jìn)行稀釋(例如:20μL尿液+80μL0.1M的HCl)。標(biāo)準(zhǔn)品無(wú)需稀釋。
10.2樣品的稀釋
如果樣品中多巴胺濃度高于最高標(biāo)準(zhǔn)品的應(yīng)按照下列所述進(jìn)行稀釋:
樣品
待稀釋
稀釋液
備注
血漿
多巴胺濃度高于最高標(biāo)準(zhǔn)品中多巴胺的濃度
雙蒸水
提取步驟前
尿液
多巴胺濃度高于最高標(biāo)準(zhǔn)品中多巴胺的濃度
0.1N的HCl
提取步驟前
 
10.3樣品、標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品的提。ㄌ崛“澹
1)
將標(biāo)準(zhǔn)品、已稀釋好的質(zhì)控品、已稀釋好的尿液樣品各30μL和750μL血漿樣品加入到提取板相應(yīng)的微孔中。除血漿樣品孔外,在所有的微孔中加入750μL雙蒸水以消除體積差別。
2)
在每一微孔中加入1000μL提取緩沖液
3)
蓋板。在軌道搖床(600-900rpm)上18-25℃的環(huán)境下提取30min。在提取過(guò)程中,液體的表面應(yīng)該會(huì)浸濕粘性金屬板,但液體的量不能超過(guò)微孔的2/3。液體是否濺出并不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
4)
移去粘性金屬板,快速棄取孔內(nèi)反應(yīng)液,在吸水紙上拍干。
5)
每孔加入2ml雙蒸水
6)
用新的粘性金屬板蓋板。在軌道搖床上(600-900rpm)18-25℃的環(huán)境下振蕩5min。液體是否濺出并不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
7)
移去粘性金屬板,快速棄取孔內(nèi)反應(yīng)液,在吸水紙上拍干。
8)
每孔加入150μL提取緩沖液,再向每孔中加入50μL酰化試劑,立即混合均勻。
9)
在軌道搖床(400-600rpm)上18-25℃的環(huán)境下提取20min。(無(wú)需蓋板)
10)
快速棄取孔內(nèi)反應(yīng)液,在吸水紙上拍干。
11)
每孔加入2ml雙蒸水。
12)
用新的粘性金屬板蓋板。在軌道搖床上(600-900rpm)18-25℃的環(huán)境下振蕩5min。液體是否濺出并不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
13)
移去粘性金屬板,快速棄取孔內(nèi)反應(yīng)液,在吸水紙上拍干。
14)
每孔加入450μL Release緩沖液。
15)
在軌道搖床(400-500rpm)上18-25℃的環(huán)境下振蕩30min。(無(wú)需蓋板)
已準(zhǔn)備好的樣品應(yīng)當(dāng)在當(dāng)天就進(jìn)行檢測(cè)。如果不行的話,您可將提取板用粘性金屬板蓋好,在2-8℃的環(huán)境下可存放一夜。
10.4凍干粉或濃縮成分的準(zhǔn)備
稀釋
成分
 
稀釋液
比例
備注
貯存
穩(wěn)定性
25ml
洗滌液
450ml
雙蒸水
1:10
充分混合
2-8℃
4W
150μL
酶聯(lián)物
15ml
洗滌緩沖液(已稀釋好)
1:101
臨時(shí)配置,僅能使用一次,混合時(shí)避免氣泡產(chǎn)生
18-25℃
5h
4
PNPP底物片
10.7ml
PNPP底物液
 
臨時(shí)配置,僅能使用一次
18-25℃
5h
11、實(shí)驗(yàn)步驟(自動(dòng)操作)
11.1 COMT酶溶液的準(zhǔn)備
注意:COMT酶溶液應(yīng)在使用前直接臨時(shí)配置
在COMT凍干粉中加入1.25ml雙蒸水,充分混和。再加入1.25ml酶聯(lián)溶液,然后再加入1.25ml酶溶液和0.40ml COMT添加劑以充分混合溶解的COMT試劑*,COMT酶溶液最后的體積為每支4.15ml。一支可做48人份。溶液可用旋渦混合器混合,但要避免氣泡產(chǎn)生,配置好的COMT溶液可在室溫下穩(wěn)定存放1小時(shí)。
*如果只需要一定量的COMT溶液,則剩余的COMT溶液應(yīng)立即凍存于-20℃的環(huán)境下。COMT溶液可在此環(huán)境下穩(wěn)定存放1-2個(gè)月。
11.2實(shí)驗(yàn)步驟
在使用自動(dòng)方法做實(shí)驗(yàn)時(shí),我們建議按1:10的比例預(yù)先稀釋提取好的標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和尿液樣品(如果是手動(dòng)操作則用Release緩沖液進(jìn)行稀釋)。如果稀釋了,第二個(gè)步驟可簡(jiǎn)化為:將已提取好的血漿樣品、已提取好的標(biāo)準(zhǔn)品(按1:10的比例預(yù)先稀釋)、質(zhì)控品和尿液樣品各100μL加入到微孔中。在進(jìn)行預(yù)稀釋時(shí),應(yīng)當(dāng)考慮到自動(dòng)操作的死容積。
1)  在包被板的每一微孔中加入75μL剛配置好的COMT酶溶液,輕輕振蕩。
2)  在尿液樣品、標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品的微孔中加入90μL Release緩沖液(血漿樣品孔除外)。將已提取好的標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和尿液樣品分別10μL加入到相應(yīng)的微孔中。在此加樣步驟中,可直接將取樣吸頭伸入到COMT溶液中。溶液顏色變成粉色,輕輕振蕩。
3)  每孔中加入50μL多巴胺抗血清。
4)  蓋板。在振蕩器(400-600rpm)上18-25℃的環(huán)境下溫育120min
5)  棄取孔內(nèi)反應(yīng)液,每孔用250-300μL已稀釋好的洗滌液洗板6次。
6)  每孔加入100μL酶聯(lián)物
7)  蓋板。在軌道搖床(400-600rpm)上18-25℃的環(huán)境下溫育60min
8)  棄取孔內(nèi)反應(yīng)液,用250-300μL已稀釋好的洗滌液洗板6次。
9)  加底物液和終止液時(shí),其時(shí)間間隔應(yīng)相同
10)             每孔加入200μL底物液
11)             在軌道搖床(400-600rpm)上18-25℃的環(huán)境下溫育40min。如果自動(dòng)操作時(shí)的溫度超過(guò)25℃時(shí),則應(yīng)相應(yīng)的將溫育時(shí)間縮短至30min。
12)             每孔加入50μL PNPP終止液以終止底物反應(yīng),輕輕振蕩包被板以充分混合試劑成分。
13)             加終止液后60min之內(nèi)405nm處讀取OD值。(參考波長(zhǎng):620-650nm)
12、期望值
實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能當(dāng)作判斷任何治療結(jié)果的唯一因素,疾病的判斷還應(yīng)當(dāng)與其它臨床觀察和診斷檢測(cè)相結(jié)合。以下結(jié)果為正常人群的正常值(5%-95%),建議每個(gè)實(shí)驗(yàn)室讀確定自己的正常值范圍:
 
尿液
血漿
μg/d
nmol/d
pg/mL
nmol/L
多巴胺
<600
<3917
<100
<0.65
 
 
 
本譯文僅供參考,詳情請(qǐng)以原文為準(zhǔn)。
 
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