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去甲腎上腺素ELISA試劑盒使用說明

瀏覽次數(shù)：3307　發(fā)布日期：2011-9-8　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

去甲腎上腺素ELISA試劑盒使用說明

(德國(guó)IBL：RE59261)

1、應(yīng)用范圍

此試劑盒可用于人血清和尿液中去甲腎上腺素的體外定量檢測(cè)。

2、臨床意義

兒茶酚胺類激素腎上腺素、去甲腎上腺素和多巴胺主要由腎上腺髓質(zhì)、交感神經(jīng)系統(tǒng)和大腦產(chǎn)生。它們幾乎影響所有的組織，并與其它激素和神經(jīng)系統(tǒng)一起參與各種生理過程的調(diào)節(jié)。在許多疾病中，兒茶酚胺激素及其代謝產(chǎn)物變腎上腺素和去甲變腎上腺素的分泌量都會(huì)增加，因而這些激素可用于疾病的診斷。所以，這些激素的檢測(cè)對(duì)于疾病的診斷及神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤疾病的具有重要意義。它主要用于嗜鉻細(xì)胞瘤的診斷，當(dāng)然也用于成神經(jīng)細(xì)胞瘤和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞瘤的診斷。因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)一開始時(shí)有提取步驟，用戶可使用各種動(dòng)物材料進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。所有動(dòng)物的兒茶酚胺的化學(xué)結(jié)構(gòu)相同，因此此試劑盒可用于測(cè)大鼠、小鼠或其它動(dòng)物。

3、實(shí)驗(yàn)原理

此固相ELISA試劑盒利用的夾心法原理。微孔中包被了羊抗兔抗體。之后加入的液態(tài)抗體可以結(jié)合到抗原分子的一個(gè)抗原決定簇上，而抗原分子可在溫育期內(nèi)結(jié)合到固相抗體上。樣品中的抗原與酶標(biāo)二抗一起在微孔內(nèi)溫育，此酶標(biāo)二抗可結(jié)合到抗原分子上的另一不同表位上。加入底物液后，溶液所顯示的顏色強(qiáng)度與樣品中抗原的量成正比。樣品的結(jié)果可直接從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取。

4、貯存與穩(wěn)定性

試劑盒和運(yùn)輸環(huán)境和儲(chǔ)存環(huán)境溫度為2-8℃，避免熱源或太陽(yáng)直射。樣品的儲(chǔ)存與穩(wěn)定性及試劑的準(zhǔn)備將在相關(guān)章節(jié)中闡述。開封的試劑盒在有效期內(nèi)穩(wěn)定，前提是將試劑盒用袋子密封并儲(chǔ)存于2-8℃的環(huán)境下。

5、樣品的采集與儲(chǔ)存

注意	人體內(nèi)的兒茶酚氨和間甲腎上腺素的釋放會(huì)受到一些食品和藥物的影響。因此在樣品采集前72小時(shí)內(nèi)病人應(yīng)禁止服用下列食物和藥品：維生素B，咖啡，香蕉，α甲基多巴，MAO，COMT抑制劑，還有降血壓類藥物。

血漿（EDTA）

注意	血液采集后兩小時(shí)內(nèi)，將血液樣品冷藏于2-8℃的環(huán)境下直致離心獲取血漿。
注意靜脈穿刺采集全血的常規(guī)注意事項(xiàng)。從采集到血液樣品的那一刻起到檢測(cè)時(shí)都應(yīng)保持血液樣品的化學(xué)整體性。不要使用明顯溶血、黃疸的和脂血樣品。如果樣品出現(xiàn)混濁，則在實(shí)驗(yàn)前應(yīng)當(dāng)離心以除去所有的微粒物質(zhì)。
貯存		2-8℃	≤-20℃	避免熱源或太陽(yáng)直射，避免反復(fù)凍融，冷凍狀態(tài)下運(yùn)輸樣品。
穩(wěn)定性		6h	1個(gè)月

尿液

可以是自然尿液也可使用24h尿液。將病人24h內(nèi)的所有尿液都收集到，并混合于含10-15ml 6N的HCl防腐劑的試劑瓶中。
貯存	≤-20℃	避免熱源或太陽(yáng)直射，避免反復(fù)凍融，冷凍狀態(tài)下運(yùn)輸樣品。
穩(wěn)定性	6個(gè)月

6、試劑盒成分

注意：試劑盒有足夠做96份單孔檢測(cè)或48份雙孔檢測(cè)所需的試劑成分

數(shù)量	標(biāo)志	成分
1×12×8	MTP	包被板，可拆，微孔中包被了抗兔IgG（羊，單克�。�。
1×6×2.5ml	CAL A-F	標(biāo)準(zhǔn)品A-F，即用腎上腺素:0;1.5;15;50;150ng/ml (0;8;27;82;273;819nmol/L) 去甲腎上素:0;5;15;50;150;500ng/mL (0;30;89;296;887;2955nmol/L) 多巴胺:0;12;35;115;450;2250ng/mL (0;78;228;750;2938;14688nmol/L) 內(nèi)含[-]腎上腺素， [-]去甲腎上腺素， [-]多巴胺(有生物活性), 0.1M的HCl
1×2×2.5ml	CONTROL 1+2	質(zhì)控品1+2 即用,含: [-]腎上腺素，[-]去甲腎上腺素， [-]多巴胺(具有生物活性),0.1M的HCl, 具體濃度及可允許范圍請(qǐng)見試劑瓶標(biāo)簽.
1×250μL	ENZCONJ CONC	酶聯(lián)物濃縮型（100×）內(nèi)含：堿性磷酸酶標(biāo)記的抗體，Tris緩沖液， HCl，0.01%的NaN3
2×	EXTRPLATE	提取板（微孔板）每板24孔，包被了硼酸親和凝膠。
1×60ml	EXTRBUF	提取緩沖液粉紅色，即用，內(nèi)含：0.016%的NaN3
2×1.25ml	COMT LYO	COMT凍干粉內(nèi)含:兒茶酚-氧位-甲基轉(zhuǎn)移酶（豬肝），NaN3
1×2ml	COMT ADD	COMT添加劑內(nèi)含:人血漿，穩(wěn)定劑，0.01%硫柳汞。
1×7ml	ANTISERUM DO	去甲腎上腺素抗血清紫羅蘭色，即用，內(nèi)含:抗去甲腎上腺素抗體（兔），緩沖液，穩(wěn)定劑。
2×1.25ml	COENZ	酶聯(lián)復(fù)合物即用，內(nèi)含：S-腺苷-L-蛋白酸，穩(wěn)定劑。
1×3ml	ENZBUF	酶緩沖液即用，內(nèi)含：Tris緩沖液，HCl，穩(wěn)定劑。
1×17ml	RELEASEBUF	Release緩沖液黃色，即用，內(nèi)含：0.1M的HCl，指示劑。
1×3ml	ACYLREAG	�；噭� 即用，內(nèi)含：二甲基甲酰胺，乙醇。注意：有毒，高可燃性。
1×50ml	WASHBUR CONC	洗滌液濃縮型（10×）內(nèi)含：Tris緩沖液，HCl，吐溫，0.2%的NaN3
1×9×	PNPP SUBS	PNPP底物片內(nèi)含：對(duì)硝基苯磷酸（PNPP）
1×27ml	PNPP BUF	PNPP底物緩沖液即用，內(nèi)含：二乙醇胺，水，0.05%的NaN3
1×15ml	PNPP STOP	PNPP終止液即用，內(nèi)含：1M的NaOH，0.25M的EDTA
3×	FOIL	粘性金屬板

7、實(shí)驗(yàn)所需器材（但試劑盒不提供）

1）移液器（10；10-100；100-1000μL）

2）軌道搖床（200-900rpm）

3）旋渦混合器

4）帶儲(chǔ)器的8通道移液器

5）洗滌瓶，自動(dòng)或半自動(dòng)包被板清洗系統(tǒng)

6）酶標(biāo)儀

7）雙蒸水或去離子水

8）吸水紙，取樣吸頭，計(jì)時(shí)器

8、實(shí)驗(yàn)前說明

注意	用于96人份檢測(cè)色試劑盒成分可分成兩次進(jìn)行,下列所述體積為做48人份時(shí)所需要的量。

8.1樣品的稀釋

如果樣品中去甲腎上腺素濃度高于最高標(biāo)準(zhǔn)品的應(yīng)按照下列所述進(jìn)行稀釋：

樣品	待稀釋	稀釋液	備注
血漿	去甲腎上腺素濃度高于最高標(biāo)準(zhǔn)品中去甲腎上腺素的濃度	雙蒸水	提取步驟前
尿液	去甲腎上腺素濃度高于最高標(biāo)準(zhǔn)品中去甲腎上腺素的濃度	0.1N的HCl	提取步驟前

8.2樣品、標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品的提�。ㄌ崛“�，手動(dòng)操作版）

1）	將標(biāo)準(zhǔn)品、已稀釋好的質(zhì)控品、已稀釋好的尿液樣品各20μL和500μL血漿樣品加入到提取板相應(yīng)的微孔中。除血漿樣品孔外，在所有的微孔中加入500μL雙蒸水以消除體積差別。
2）	在每一微孔中加入1000μL提取緩沖液
3）	蓋板。在軌道搖床（600-900rpm）上18-25℃的環(huán)境下提取30min。在提取過程中，液體的表面應(yīng)該會(huì)浸濕粘性金屬板，但液體的量不能超過微孔的2/3。液體是否濺出并不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
4）	移去粘性金屬板，快速棄取孔內(nèi)反應(yīng)液，在吸水紙上拍干。
5）	每孔加入2ml雙蒸水
6）	用新的粘性金屬板蓋板。在軌道搖床上（600-900rpm）18-25℃的環(huán)境下振蕩5min。液體是否濺出并不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
7）	移去粘性金屬板，快速棄取孔內(nèi)反應(yīng)液，在吸水紙上拍干。
8）	每孔加入150μL提取緩沖液，再向每孔中加入50μL�；噭�，立即混合均勻。
9）	在軌道搖床（400-600rpm）上18-25℃的環(huán)境下提取20min。（無需蓋板）
10）	快速棄取孔內(nèi)反應(yīng)液，在吸水紙上拍干。
11）	每孔加入2ml雙蒸水。
12）	用新的粘性金屬板蓋板。在軌道搖床上（600-900rpm）18-25℃的環(huán)境下振蕩5min。液體是否濺出并不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
13）	移去粘性金屬板，快速棄取孔內(nèi)反應(yīng)液，在吸水紙上拍干。
14）	每孔加入300μL Release緩沖液。
15）	在軌道搖床（400-500rpm）上18-25℃的環(huán)境下振蕩30min。（無需蓋板）

已準(zhǔn)備好的樣品應(yīng)當(dāng)在當(dāng)天就進(jìn)行檢測(cè)。如果不行的話，您可將提取板用粘性金屬板蓋好，在2-8℃的環(huán)境下可存放一夜。

9、實(shí)驗(yàn)步驟

9.1 COMT酶溶液的準(zhǔn)備

注意：COMT酶溶液應(yīng)在使用前直接臨時(shí)配置。

在COMT凍干粉中加入1.25ml雙蒸水，充分混和。再加入1.25ml酶聯(lián)溶液，然后再加入1.25ml酶溶液和0.40ml COMT添加劑以充分混合溶解的COMT試劑*，COMT酶溶液最后的體積為每支4.15ml。一支可做48人份。溶液可用旋渦混合器混合，但要避免氣泡產(chǎn)生，配置好的COMT溶液可在室溫下穩(wěn)定存放1小時(shí)。

*如果只需要一定量的COMT溶液，則剩余的COMT溶液應(yīng)立即凍存于-20℃的環(huán)境下。COMT溶液可在此環(huán)境下穩(wěn)定存放1-2個(gè)月。

9.2樣品、標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品的酶分化

注意	如果要檢測(cè)腎上腺素和去甲腎上腺素，我們建議您先檢測(cè)腎上腺素。如果使用自動(dòng)置換型衣液器加樣，請(qǐng)將取樣吸頭內(nèi)的殘余液體加入到提取板的相應(yīng)微孔內(nèi)，否則剩余的提取液不夠去甲腎上腺素檢測(cè)用。將提取板放到有一定坡度的位置上。實(shí)驗(yàn)開始前，確定好腎上腺素和去甲腎上腺素的檢測(cè)孔并標(biāo)記好。

9.3尿液與血漿中的去甲腎上腺素

1	在每一微孔內(nèi)加入25ul臨時(shí)配制的COMT酶溶液，輕輕振板以使溶液混合均勻。
2	將提取好的標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和樣品分別25ul加入到相應(yīng)的微孔內(nèi)。在此步驟中，我們可以將取樣吸頭直接深入到COMT溶液里。加樣后，溶液顏色變成粉色，輕輕振板以使溶液混合均勻。
3	向每一微孔中加入50ul去甲腎上腺素抗血清（藍(lán)色）。
4	蓋板，在軌道搖床上（400-600rpm）18-25℃的環(huán)境下孵育120min。

8.4凍干粉或濃縮成分的準(zhǔn)備

稀釋	成分		稀釋液	比例	備注	貯存	穩(wěn)定性
20ml	洗滌液	180ml	雙蒸水	1：10	充分混合	2-8℃	4W
60μL	酶聯(lián)物	6ml	洗滌緩沖液（已稀釋好）	1：101	臨時(shí)配置，僅能使用一次，混合時(shí)避免氣泡產(chǎn)生	18-25℃	30min
4	PNPP底物片	10.7ml	PNPP底物緩沖液		臨時(shí)配置，僅能使用一次	18-25℃	10min

9.5 ELISA實(shí)驗(yàn)步驟

1）移去粘性金屬板，棄取孔內(nèi)反應(yīng)液，每孔用250-300ul稀釋好的洗滌液洗板4次。最后在吸水紙上拍干以除去殘余液體。

2）在每一微孔中加入100ul臨時(shí)配置好的酶聯(lián)物。

3）蓋板，在軌道搖床上（400-600rpm）18-25℃的環(huán)境下孵育60min。

4）移去粘性金屬板，棄取孔內(nèi)反應(yīng)液，每孔用250-300ul稀釋好的洗滌液洗板4次。最后在吸水紙上拍干一除去殘余液體。

5）如果可以的話，使用8道移液器加底物液和終止液。加底物液和終止液的時(shí)間間隔應(yīng)當(dāng)相同，使用自動(dòng)置換型移液器并避免氣泡產(chǎn)生。

6）在每一微孔中加入200ul底物液。

7）不要蓋板，在軌道搖床上（400-600rpm）18-25℃的環(huán)境下孵育60min。

8）在每一微孔內(nèi)加入50ulPNPP終止液以終止酶反應(yīng)。輕輕振板以使溶液混合均勻。

9）加終止液后60min內(nèi)405nm處讀取OD值。

10、期望值

實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能當(dāng)作判斷任何治療結(jié)果的唯一因素，疾病的判斷還應(yīng)當(dāng)與其它臨床觀察和診斷檢測(cè)相結(jié)合。以下結(jié)果為正常人群的正常值（5%-95%），建議每個(gè)實(shí)驗(yàn)室讀確定自己的正常值范圍：

	尿液		血漿
	μg/d	nmol/d	pg/mL	nmol/L
去甲腎上腺素	＜90	＜535	＜600	＜3.55

本譯文僅供參考，詳情請(qǐng)以原文為準(zhǔn)。

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