TRIzol法同時提取RNA、DNA、蛋白質(zhì)

     TRIzol試劑適用于從細胞和組織中快速分離RNA。TRIzol試劑有多組分分離作用，與其他方法如硫氰酸胍/酚法、酚/SDS法、鹽酸胍法、硫氰酸胍法等相比，最大特點是可同時分離一個樣品的RNA\DNA\蛋白質(zhì).TRIzol使樣品勻漿化，細胞裂解，溶解細胞內(nèi)含物，同時因含有RNase抑制劑可保持RNA的完整性。在加入氯仿離心后，溶液分為水相和有機相，RNA在水相中。取出水相用異丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中間層可回收DNA；用異丙醇沉淀有機相可回收蛋白質(zhì)。

RNA的提取

準備試劑：氯仿，異丙醇，75℅乙醇，無RNase的水或0.5℅SDS（溶液均需用DEPC處理過的水配制）。

操作步驟：

1. 勻漿處理：

a.組織將組織在液氮中磨碎，每50～100mg組織加入1ml TRIzol，用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細胞　直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm²面積（即3.5cm直徑的培養(yǎng)板）加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c.細胞懸液離心收集細胞，每5～10×10⁶動物、植物、酵母細胞或1×10⁷細菌細胞加入1mlTRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。

2.將勻漿樣品在室溫（15～30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。(我們是5分鐘)

4. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色（我們見到的是紅色）有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

5. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1mlTRIzol加入0.5ml異丙醇（加入移出液相等體積），室溫放置10分鐘。

6. 2～8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

8. 用75℅乙醇洗滌RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。2～8℃不超過7500×g離心5分鐘，棄上清。

9.室溫放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大約晾5～10分鐘即可.不要真空離心干燥，過于干燥會導致RNA的溶解性大大降低。加入25～200μl無RNase的水或0.5℅SDS，用槍頭吸打幾次，55～60℃放置10分鐘使RNA溶解。如RNA用于酶切反應(yīng)，勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅的去離子甲酰胺溶解，-70℃保存。

預防RNase污染注意事項：

1.經(jīng)常更換新手套，皮膚上常帶有的細菌，霉菌可能成為RNase的來源。

2.使用滅過菌的RNA專用塑料制品避免交叉污染。

3.RNA在TRIzol試劑中時不會被RNase污染，但提取后繼續(xù)處理過程中應(yīng)使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小時，塑料制品可在0.5M NaOH中浸泡10分鐘，然后用水徹底清洗，高壓滅菌，即可去除RNase。

4.配制溶液應(yīng)使用無RNase的水（將水加入處理過不含RNase的玻璃瓶中，加入DEPC至終濃度0.01℅v/v，放置過夜，高壓滅菌。注：DEPC有致癌之嫌，需小心操作）。

注意事項：

1.從少量樣品（1～10mg組織或102～104細胞）中提取RNA時可加入少許糖原以促進RNA沉淀。例如加800mlTRIzol勻漿樣品，沉淀RNA前加5～10μgRNase-free糖原。糖原會與RNA一同沉淀出來，糖原濃度不高于4mg/ml是不影響第一鏈的合成，也不影響PCR反應(yīng)。

2.勻漿后加氯仿之前樣品可以在-60至-70℃保存至少一個月。RNA沉淀可以保存于75% 酒精中2～8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。

3.分層和RNA沉淀時也可使用臺式離心機，2600×g離心30～60分鐘。

預期產(chǎn)量：1mg組織或1×106細胞提取RNA分別為：

肝和脾6～10μg ，腎3～4μg ，骨骼肌和腦組織1～1.5μg ，胎盤1～4μg ，上皮細胞8～15μg ，成纖維細胞5～7μg 。

常見問題分析：

得率低：

A.樣品裂解或勻漿處理不徹底。

B.RNA沉淀未完全溶解。

A260/A280<1.65 ：

A.檢測吸光度時，RNA樣品沒有溶于水，而溶于了TE中。低離子濃度和低pH值條件下A280值偏高。

B.樣品勻漿時加的試劑量太少。

C.勻漿樣品時未在室溫放置5分鐘。

D.吸取水相時混入了有機相。

E.RNA沉淀未完全溶解。

RNA降解：

A.組織取出后沒有馬上處理或冷凍。

B.待提取RNA的樣品沒有保存于-60至-70℃，而保存在了-5至-20℃。

C.細胞在用胰酶處理時過度。

D.溶液或離心管未經(jīng)RNase去除處理。

E.電泳時使用的甲醛pH值低于了3.5 。

DNA污染：

A. 樣品勻漿時加的試劑量太少。

B.樣品中含有有機溶劑（如乙醇，DMSO等），強緩沖液或堿性溶液。

蛋白聚糖和多糖污染：

沉淀RNA的過程中作以下改進可去除這些污染，步驟7中，每使用1ml TRIzol在水相中加0.25ml異丙醇和0.25ml高鹽溶液（0.8M檸檬酸鈉和1.2MNaCl）混合離心，按之前操作進行。這種方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，高效沉淀出純RNA。從含有大量多糖的植物中提取RNA時應(yīng)在勻漿后離心，并加上以上操作步驟。

 

DNA的分離

準備試劑：乙醇0.1M檸檬酸鈉（含10%乙醇）、 75%乙醇、8mM NaOH

操作步驟：

1. 樣品加氯仿分層后，移去上層水相，用乙醇沉淀中間層和有機相中的DNA。每使用1mlTRIzol加0.3ml無水乙醇混勻，室溫放置3分鐘，2～8℃不超過2000×g離心5分鐘。

2. 移去上清，（如需分離蛋白質(zhì)，可保留，進一步操作見后）用含10%乙醇的0.1M檸檬酸鈉洗滌DNA沉淀。每用1mlTRIzol加入1ml檸檬酸鈉，室溫放置30分鐘，2～8℃2000×g離心5分鐘，棄上清，重復一次�？梢栽僦貜鸵淮�。

3. 用75%乙醇再洗一遍DNA沉淀，每用1ml TRIzol加入1.5～2 ml75%乙醇，室溫放置10～20分鐘（不時顛倒混合）2～8℃2000×g離心5分鐘， 棄上清。

4. 室溫放置晾干DNA 5～15分鐘，用8mM NaOH溶解DNA。從50～70mg組織或107細胞中分離的DNA溶于300～600μl 8mM NaOH，DNA的濃度通常為0.2～0.3μg/μl。提取的DNA沉淀不易溶于水和Tris緩沖液中，建議用弱堿溶解，8mMNaOH的pH值為9，溶解DNA后可用TE，HEPES調(diào)節(jié)pH。從某些樣品（尤其是組織）中提取的DNA中可能包含一些膠狀不溶物可>12000×g離心10分鐘除去。

DNA的定量：取一份溶于8mMNaOH的DNA加水測A260值。一單位A260值相當于50μg/ml雙鏈DNA。根據(jù)DNA產(chǎn)量可估計細胞數(shù)，人、大鼠、小鼠、1×106二倍體細胞含DNA的量分別為7.1μg，6.5μg，5.8μg。

預期產(chǎn)量：1mg組織或1×106細胞提取DNA分別為肝和腎3～4μg 骨骼肌，腦組織，胎盤2～3μg 人，大鼠，小鼠培養(yǎng)細胞（1×106）5～7μg 成纖維細胞5～7μg。

應(yīng)用：

1.用于PCR 溶于8mM NaOH的DNA用0.1M HEPES調(diào)pH至8.4，取0.1～1μg DNA用作模板。

2.酶切反應(yīng)用HEPES或1mM EDTA調(diào)節(jié)pH至適當值。每μg DNA使用3～5單位的酶，80～90%的DNA是可消化的。

1ml 8mM NaOH溶解的DNA樣品pH值調(diào)節(jié)

Final pH  0.1M HEPES（μl） Final pH   1M HEPES（μl）

8.4       86                 7.2         23

8.2       93                 7.0         32

8.0      101

7.8      117

7.5      159

注意事項：

1. DNA在中間層和有機相中時可在2～8℃保存過夜。

2.DNA沉淀在75%乙醇中2～8℃可保存幾個月。

3.DNA在8mM NaOH溶液中4℃可放置過夜，如長期保存需用HEPES調(diào)節(jié)pH至7～8并且加EDTA至1mM，可置于4℃或-20℃長期保存。

常見問題分析：

得率低：

A.樣品勻漿和裂解的不徹底。

B.最終得到的DNA沉淀沒有完全溶解。

A260/A280<1.70 ：

A. 檢測吸光度時，RNA樣品沒有溶于水，而溶于了TE中。

B.酚除去的不徹底，可用0.1M檸檬酸鈉（含10%乙醇）再洗一遍DNA沉淀。

DNA降解：

A.組織取出后沒有馬上處理或冷凍。

B.待提取RNA的樣品沒有保存于-60至-70℃，而保存在了-5至-20℃。

C.樣品勻漿時使用了高速勻漿儀。

RNA污染：

A.氯仿分層后水相去除的不干凈。

B.DNA沉淀用0.1M檸檬酸鈉（含10%乙醇）洗的不徹底。

蛋白質(zhì)的提取

準備試劑：異丙醇、含0.3M鹽酸胍的95%乙醇、無水乙醇、1%SDS。

操作步驟：

1.取沉淀DNA后剩余的上清，用異丙醇沉淀蛋白質(zhì)。每使用1ml TRIzol加1.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘，2～8℃12000×g離心10分鐘棄上清。

2.用含0.3M鹽酸胍的95%乙醇洗滌蛋白質(zhì)沉淀。每使用1mlTRIzol加2ml洗滌液，室溫放置20分鐘，2～8℃7500×g離心5分鐘，棄上清，重復兩次。用2ml無水乙醇同樣方法再洗一次。

3.真空抽干蛋白質(zhì)沉淀5～10分鐘，用1%SDS溶解蛋白質(zhì)，反復吸打，50℃溫浴使其完全溶解，不溶物2～8℃10000×g離心10分鐘除去。分離得到的蛋白質(zhì)樣品可用于Western Blot或-5至-20℃保存?zhèn)溆谩?SPAN lang=EN-US>

注意事項：

1.蛋白質(zhì)沉淀可保存在含0.3M鹽酸胍的95%乙醇或無水乙醇中2～8℃一個月以上或-5至-20℃一年以上。

2.用0.1% SDS在2～8℃透析三次，10000×g離心10分鐘取上清即可用于Western Blot。

常見問題分析：

得率低：

A.樣品裂解或勻漿處理不徹底。

B.最后得到的蛋白質(zhì)沉淀未完全溶解。

蛋白質(zhì)降解：組織取出后沒有馬上處理或冷凍。

電泳時條帶變形：蛋白質(zhì)沉淀洗滌不充分。

操作步驟：

1．      用Trizol試劑勻漿細胞和組織的方法同RNA提取步驟。

2．      在細胞勻漿中加入氯仿，每1ml Trizol的起始用量加入0.2ml氯仿。劇烈震蕩30秒鐘后室溫放置2~3分鐘。

3．      4℃下10,000g離心10分鐘。

4．      小心吸取并丟棄上層水相（該水相中富含細胞總RNA，如果需要提取RNA，則收集該水相）。

5．      在剩下的中間層及有機相中加入無水乙醇，每1ml 起始Trizol用量加入0.3ml無水乙醇。顛倒充分混勻后室溫放置2~3分鐘。

6．      4℃下2,000g離心5分鐘。

7．      小心吸取并收集上層的酚醇有機相（沉淀為DNA），轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中，加入異丙醇，每1ml 起始Trizol用量加入1.5ml異丙醇。輕輕混勻后室溫放置10分鐘。

8．      4℃下12,000g離心10分鐘。

9．      丟棄上層液相，沉淀即為蛋白質(zhì)。用清洗液（鹽酸胍溶于95%乙醇中，終濃度為0.3M）清洗沉淀3次。每1ml 起始Trizol用量加入2ml清洗液清洗。在每次清洗過程中，先將沉淀保留于清洗液中20分鐘（室溫下），然后在4℃下7,500g離心5分鐘。最后一次清洗后，丟棄上層液相，將沉淀懸浮于2ml乙醇中，渦旋震蕩15秒后在室溫下放置20分鐘，然后在4℃下7,500g離心5分鐘。

10.  丟棄上層液相，將沉淀真空干燥5~10分鐘。然后將沉淀溶解于1% SDS（十二烷基硫酸鈉）中�？捎�50℃水浴中用tip頭反復吹打以助溶。不溶物在4℃下10,000g離心10分鐘去除。收集上清，轉(zhuǎn)移到新的收集管中。該上清中的蛋白樣品可直接用于Western Blotting實驗或保存于-20℃。

²        附注：

1.         蛋白沉淀保存于清洗液（鹽酸胍溶于95%乙醇中，終濃度為0.3M）中，或保存于乙醇中，在4℃下可保存至少一個月，在-20℃下可至少保存一年。

2.         在上述步驟7中收集的酚醇有機相，可用0.1% SDS透析三次，透析后4℃下10,000g離心10分鐘。上清液可直接用于Western Blotting實驗。如果采用這種實驗方案，可提高蛋白的回收效率。

3.         如果蛋白溶液中的SDS濃度高于0.1%，則不宜采用考馬斯亮蘭染色法（Bradford）法對蛋白定量。因為蛋白溶液中可能含有痕量酚，也不宜采用紫外分光光度法定量蛋白質(zhì)。采用上述方法提取的蛋白，可以用lowry法或BCA法進行蛋白定量。